これまで最も長生きしたことが知られているのはフランス人の女性で122歳だ。おそらく120歳を超えたのはこの人だけだと思うが、100歳を超える人の数が7万人を超える今でも110歳を超えることは簡単ではなく、我が国でも110歳を超えた supercentenarian の数は114に満たない。

今日紹介するスペインのホセカレーラス白血病研究所からの論文は、117歳まで生存して2024年になくなったスペイン女性について老化に関わる様々な指標を徹底的に調べた研究だ。一例報告なので軽々に結論するのは戒めるとして、しかし様々なヒントを教えてくれる研究で、10月21日 Cell Reports Medicineに掲載された。タイトルは「The multiomics blueprint of the individual with the most extreme lifespan（極端に長生きした一人の女性のマルチオミックス青写真）」だ。

最近では生物学的老化を調べる様々な指標が開発されているが、この研究ではそれらの全てを117歳のスペイン女性について調べている。多くのデータが示されているが、面白いと思われるポイントだけを箇条書きにしてみた。

1. 老化と言えば時間とともに短くなるテロメアが出てくるが、驚くことにこの女性は長生きしているにもかかわらず血液細胞のテロメアが短い。おそらくこれまで調べられた中では最も短いテロメアで、コントロールと比べて40％短い。この方は検査の後少しして亡くなっているので、テロメアが短いためとも言えるが、逆になくなるまでガンや心臓病などの病気らしい病気にかかっていないことを考えると、テロメアが短いからといって必ずしも病気になるわけではないこともわかる。
2. この方に特異的なゲノム変異を探索した結果、16種類のコーディング遺伝子、3種類のノンコーディング遺伝子のホモ接合性変異が特定されている。バリアントがホモ接合したケースはコントロールで全く認められないレアバリアントなので、超長寿に関わる可能性がある。これらの遺伝子は免疫系、認知、さらに動物の寿命に関わることが知られている遺伝子で、納得できる。即ち、いくつかの寿命に関わる遺伝子がいくつか合わさった結果が超長寿につながっていると言える。
3. 一方、多くの研究で寿命を縮める事がわかっている様々な遺伝子変異を調べると、ほとんど存在しないことも明らかになり、超長寿には遺伝的背景が重要であることがわかった。
4. 以前115歳の超長寿者の血液がたった2個の造血幹細胞でまかなわれているという論文を紹介したことがあるが (https://aasj.jp/news/watch/1464) 、ここまで極端ではないが、老化に伴うクローン性増殖ははっきりと見られ、しかもTET2等の変異も特定される。この方ではMycの活性化を伴うB細胞のクローン増殖が際立っているが、他の超長寿者を調べると、B細胞の増殖が一般的でないこともわかる。いずれにせよ、変異も認められるクローン増殖状態が腫瘍にまで至っていない点で、この理由がわかると長寿への介入法が一つ明らかになるかもしれない。
5. オートファジーも老化とともに大きく変化することが知られているが、この方では様々な分子マーカーで調べたオートファジー機能は若い人と同じレベルを保っていた。
6. うらやましいのは脂肪代謝を調べると、VLDLレステロールがおそらく何もしていなくても極めて低値を維持しており、逆にHDLコレステロールは高い。即ち生活習慣も含め、若い血管を保つ要因を備えている。タンパク質解析からも、脂質のトランスポートや、リポプロテイン除去機能が若々しく保たれているのが確認される。
7. 老化の指標である自然炎症のマーカーも低いレベルを保っているが、獲得免疫に関わる細胞やタンパク質は若いレベルを保っている。
8. 現在老化指標として広く用いられる血液細胞のDNAメチル化も調べて、生物学時計の進み方が通常よりかなり遅いことを確認している。
9. 最後に腸内細菌叢についても検討し、Bifidobacterium が群を抜いて高いことを発見している。この方はずっと多くのヨーグルトを摂取されており、これを反映しているのかもしれない。

最初に述べたようにこれは一例のケースレポートで一般化は難しいが、希な遺伝的背景に恵まれて、生活習慣病とは無縁の生活を送ることが超長寿の秘訣になる。いずれにせよ、我々凡人は超長寿とは無関係なことがよくわかる研究だった。

ALSは進行性の神経変性疾患で、現在のところ神経細胞やグリア細胞の内因的原因で起こると考え研究や治療開発が行われている。例えば昨年認可された変異SOD1の発現を抑える核酸薬はその代表的な例と言えるだろう。我が国でもCiRAの井上さんたちは iPS由来神経オルガノイドを用いた創薬研究を行っているが、この実験系では基本的に自己免疫疾患のような免疫メカニズムは想定していない。

一方で、これまでこのブログでも紹介したが、免疫系の関与を示唆する研究も存在する。一つは3例の患者さんに制御性T細胞を末梢血から純化し戻すと、細胞が作用している間は進行が止まるという研究だ（https://aasj.jp/news/watch/8483）。さらに、マウスでT細胞が媒介する自己免疫ALSモデルを作成し他研究も紹介した（https://aasj.jp/news/watch/19988）。

今日紹介する La Jolla 免疫研究所からの論文は、ASLの患者さんの末梢血のリンパ球を取り出し、ALS に関わるTD-43、SOD-1、C9orf72由来ペプチドに対する反応を詳しく調べ、ALS患者さんでは C9orf72 由来の様々なペプチドに反応してIL-5分泌など主に2型免疫反応を示すCD4T細胞の活性が上昇していることを示し、ALSも自己免疫として治療開発を行う価値があるのではと提案する研究で、10月1日 Nature にオンライン掲載された。タイトルは「Autoimmune response to C9orf72 protein in amyotrophic lateral sclerosis（ALSではC9orf72mタンパク質に対する自己免疫反応が見られる）」だ。

研究ではともかくALSの患者さんでALS関連分子に対する免疫反応を検出できるかに絞って調べている。 La Jolla 免疫研究所はコロナパンデミックでいち早く患者さんのT細胞免疫を調べた論文を発表した研究所で、ヒトの免疫反応検出では定評がある。

まず末梢血T細胞タイプの変化を調べると、増加しているポピュレーションは全く見られず、逆にMAITと呼ばれる粘膜免疫に関わるT細胞やTh1型のT細胞の減少が見られている。

次に、それぞれの抗原に対応するオーバーラップする15アミノ酸からなるペプチドプールを抗原として患者さんの末梢血の反応を見ている。ただ、反応するT細胞の数が少ないので、まず2週間抗原反応性細胞を増加させたあとで、同じ抗原で二次刺激を行い、様々なサイトカインの分泌反応を見ている。

結果だが、ALSとコントロールの反応を比べた時、ALS特異的反応が見られたのは C9orf72 に対してのみで、しかもインターフェロン分泌のTh1反応ではなく、IL-5やIL-10を分泌するTh2反応優性であるという不思議な結果が出ている。一方、パーキンソン病やアルツハイマー病の患者さんの末梢血も C9orf72 に反応するが、ほとんどがインターフェロン分泌するTh1がたであることも確認している。

以上から、ALSでは C9orf72 に対するTh1反応が上昇していると結論できるが、実際反応している細胞を調べると、DD4陽性のTh2型細胞であることが確認された。

この研究の圧巻は、ALS患者さんのT細胞が反応する個々のペプチドを特定している点だ。これまでの様にまず全てのペプチドをプールして刺激の後、次に10種類のペプチドで刺激を続け、最後に個々のペプチドに対する反応でサイトカイン分泌を調べると、それぞれのペプチドに対する反応が測定できる。なかなか凝った実験系だ。驚くのは、何人もの患者さんが反応する C9orf72 由来のペプチドがいくつも存在することで、例えば C9orf72 の57番目から70番目までのペプチドにはなんと3割の人が反応し、反応レベルも群を抜いて高い。要するに、なぜかALSの患者さんでは C9orf72 由来の様々なペプチドに対してTh2型の反応が起こっているということだ。また、それぞれのペプチドのHLAとの結合についても調べており、多くの人に反応するペプチドは確かに多くのHLAと結合できる。

しかし、これだけのデータでALSが自己免疫疾患だというのは早いと思う。これを証明するには免疫系を対象にした治療の結果病気を抑えられることを示す必要がある。これにはまだまだ時間がかかるだろう。さらに不思議なことに、ALSの患者さんでは C9orf72 のマクロファージでの発現が低下することが知られており、抗原が過剰に作られるという単純な話ではない。

実際、進行の遅い患者さんではペプチド刺激によるIL-10分泌反応が5倍以上高いこともわかっており、免疫反応の一部は病気の進行を抑えていることも示唆されている。逆に言うと、C9orf72 に対するIL-10反応を高めることで病気の進行を抑えられることすら考えられる。

以上のように、ALSの患者さんで C9orf72 に対する免疫反応が見られることは間違いないが、これらの免疫反応の病気に対する効果はまだまだわかっていないと結論するのが正しいだろう。面白いのは、ALSリスクの高い C9orf72 突然変異を持っている患者さんでは C9orf72 に対する免疫反応が何倍も高い。従って、神経変性と免疫反応が複雑に絡み合っていることは間違いなさそうだが、どちらが原因かについてはわからない。もし免疫が原因なら治療可能性が出てくるのだが。

腸上皮幹細胞がγδT細胞、上皮内T細胞、あるいは自然免疫に関わるILC等から分泌されるIL-22等のサイトカインによって調節を受けていることはよく知られた事実で、このメカニズムを強めることは腸管の再生力を高め、ひいては抗老化にもつながると考えられる。

今日紹介するMITからの論文は、システインの豊富な食事、あるいはシステインを摂取するだけで、特に上皮内CD8T細胞と上皮幹細胞 (ISC) の相互作用を通してISCの再生能力を高めることを示した研究で、10月1日 Nature にオンライン掲載された。タイトルは「Dietary cysteine enhances intestinal stemness via CD8 + T cell-derived IL-22（食事中のシステインはCD8T細胞由来IL-22を介して腸幹細胞の幹細胞能力を高める）」だ。

おそらくこのグループは腸管幹細胞のケトン合成酵素が食事により変化する現象に焦点を当てて研究していたように思う。ケトン体は当然幹細胞性活性を高めるので、ISCのケトン体合成に関わるHMGC2発現に影響するアミノ酸を一つづつ摂取させて調べた結果、システインが最も高いHMGC2誘導効果を示すことを発見した。種明かしをしてしまうと、最終的にシステインはHMGC2とは別の経路でISCを活性することがわかるのだが、システインを多く摂取させると幹細胞の増殖が高まり、放射線障害に対しても回復が早いことを発見する。

なぜシステイン摂取でISCの増殖力が上がるのか探索するうちに、システインを摂取したマウスでは腸管上皮のCD8T細胞の数が増加していることに気づく。とすると、ISCの増殖はCD8T細胞から分泌されるIL-22によって誘導されている可能性が浮上した。そこでT細胞の存在しないRAGノックアウトマウスにシステイン食を摂取させISC増殖を調べると、全く増殖が起こっていないことがわかり、CD8T細胞を介してISCが増殖していることを確認している。

次に、IL-22がシステイン食によるISC増殖のメインの要因かどうかIL-22ノックアウトマウスを用いて調べ、ノックアウトマウスではシステイン食のISCへの効果は全くないが、CD8T細胞の増加は見られることを発見する。即ち、システインによりCD8T細胞は増殖するが、IL-22ができないとCD8T細胞が増えても、ISCには何も起こらないことが明らかになった。

ではシステイン摂取によるCD8T細胞の増殖はどのようなメカニズムで誘導されるのか？アミノ酸は細胞内にトランスポーターを通じて吸収されるが、システインのトランスポーターは小腸の上皮に強く発現しているが大腸上皮や他の細胞では発現が低い。システイン摂取後の代謝物の動向を調べると小腸で代謝物が生成していることがわかり、システインはまず小腸の上皮に吸収されると考えられる。中でもCoenzymeA (CoA) はシステイン摂取に依存しており、これが上皮内で増殖することが最初の引き金になっている可能性が高い。そこで、CoAを直接摂取させると、システイン摂取とほぼ同じT細胞増加IL-22分泌、そしてISC増殖が見られることが予想通り確認された。

以上が結果で、なぜCoAが上皮で上昇するとT細胞が増加するのかについてははっきりしないが、CoAが直接CD8T細胞に作用するという話もあり、このようなメカニズムでT細胞が増殖し、IL-22を分泌することで、ISCの再生力を高めていることになる。とすると、システインは腸の幹細胞システム維持の重要なサプリメントになる可能性もあり、アンチエージング効果も期待できるかもしれない。もちろんガンの増殖を促す心配はあるが、直腸にはほとんど作用しないので、システインの抗酸化作用も合わせてサプリとして使われるような気がする。

組織レベルで細胞ごとに多くの遺伝子の発現を調べる方法が急速に進んでおり、AASJでも新しい組織学としてYouTube配信を2年前に行った（https://www.youtube.com/watch?v=KtjY4JEEjaA）。これまで開発された方法は、バーコード配列を組織上で読み取って mRNAをsingle molecule レベルで特定する方法と、識別のための読み取り配列を持つプローブを標的にハイブリダイズさせたあと、読み取り配列を検出する蛍光ラベルしたプローブを組織上で何度も繰り返す方法に分かれる。特に後者の方は必要なリエージェントやRNAの数を細胞ごとにカウントするソフトも提供され、また外注でサービスを受けることもできることから、普及が進んできた。

とは言え、MERFISHは一つの遺伝子に何個ものプローブが必要で、コストも含めて気軽に使えるというレベルにはなっていない。今日紹介するイェール大学からの論文は、MERFISHを利用するが、新しく開発したRNAを組織内で増幅する方法を組み合わせることで、MERFISHを一つのプローブだけでできるようにし、感度を上げた上にコストを下げることに成功した方法開発研究で10月1日 Cell にオンライン掲載された。タイトルは「Sequencing-free whole-genome spatial transcriptomics at single-molecule resolution（配列決定が必要でない単一分子解像度での全ゲノム空間トランスクリプトミックス）」だ。

これまでも組織上でRNAを増幅することは行われていたが、この研究では標的のRNAに接して結合する2種類のプローブに、片方には増幅のためのプライマー、もう片方には増幅される配列を結合させて、ハイブリダイゼーションしたRNA上でプライマーから標的配列まで何度も増幅できるようにしている。トリックとして、増幅される共通配列には最初切断を入れておいて、増幅が標的配列まで進まないようにしておく。まずこれを連結させる操作を行ったあと、プライマーから増幅させると、今度は標的のRNAも配列まで到達して増幅させることができる。この増幅したDNA配列を標的にMERFISHを行うと、一つのプローブで十分検出が可能になる。

この増幅セットを転写される全ての遺伝子に対して用意しておいて、増幅後にMERFISHで増幅された遺伝子を検出すると、一つのRNAは一個の明確なドットとして検出できる。人間で転写される16501個のコーディングRNAと、6811個のノンコーディングRNA全ての発現解析を肺ガン細胞株で行うと、一個の細胞あたり平均3749個のRNA を検出できる。

これまでin situ hybridizationというと、見たい遺伝子を決めて調べる方法だったが、一つの組織で全遺伝子について発現を調べられるということは、細胞が発現している遺伝子について予断を完全に排して解析ができることを意味する。即ち現在定番になった single cell RNA sequencing と同じレベルの解析に、組織上の局在まで加えて解析が可能になった。

このパワーを示すためいくつかの例を選んで解析を行っている。まず培養細胞を用いて全ゲノムレベルの発現解析を行うと、多くの遺伝子発現を見事に細胞周期ごとに振り分けることができる。中でもこれまで解析が進んでいないノンコーディングRNAのうち99種類は明確に細胞周期に割り当てられることを示している。

次に構築と全ゲノム発現解析を合体させるパワーを示すため、肝臓組織について同じように全ゲノムレベルの発現解析を行い、single cell RNA seq 以上の解像度で細胞を分類できること、さらにそれぞれの細胞が組織のどこに存在するのかについて明らかにすることに成功している。このおかげで、それぞれのゾーンに分布する細胞間の相互作用についても発現遺伝子から推定することができる。

他にも胎児の胎盤、あるいは免疫反応が起こっているリンパ節についても解析を行い、例えば胎盤では血管内皮、赤芽球、栄養膜細胞、マクロファージなどの局所での相互作用の様態を示したり、リンパ節では様々なゾーニングとともに胚中心がはっきりと他のゾーンから区別できることも美しい写真で示している。

他にもクリスパーノックアウトとの組み合わせられることなどを示しているが割愛する。結局論文を読んで貰わないと、どれだけパワフルな方法かを文章だけで伝えることはむずかしい。要するに、組織上で全ゲノムレベルの遺伝子発現を解析できる、これまでより高い信頼性を持った方法が開発されたことがこの研究の全てだ。あとは個々の生物学的問題をこの方法で解析していくことで評価が定まると思う。

この研究では、全ゲノム分のプローブを作る（あるいは買う）と、あとは増幅していくらでも新しい実験に使えることから、コストもMERFISHより遙かに安上がりだとしている。組織上での増幅に必要な全プローブのコストは、5100ドルで、2000回の実験が可能でとしているので、本当なら是非試してみる価値はある。ひょっとしたら、組織全ゲノム解析の定番になるかもしれない。

最近 Nature Medicine に発表された論文の中に、変わった切り口の臨床研究を見つけたので紹介する。

最初は糖尿病予備軍の糖尿病への移行を防ぐため、食事の改善や運動を取り入れたプログラムを参加者に1年間行って貰い、その後の9年にわたる経過観察で、実際に糖尿病への移行をかなりの程度防ぐことができたコホート研究の中から、体重が低下しない、あるいは増えたにも関わらず糖尿病予防が達成できたグループを抜き出して調べた研究で、タイトルは「Prevention of type 2 diabetes through prediabetes remission without weight loss（2型糖尿病を体重の減少なしに予防できるケース）」だ。

このような介入試験の常だが、1100人あまりの参加者のうち、230人は体重減少を達成できなかった。しかしながら、このうち50人は糖尿病予防が達成できており、体重減少と糖代謝の改善が乖離した。そこで、介入によって体重減少が達成できず、糖尿病の予防が達成できないグループ（non-responder）と、予防が達成できたが体重は減少しなかったグループ (responder) について、その差を探索している。結果をまとめると、

1. 50人の responder では、介入によりインシュリン感受性が改善している。
2. Responder ではインシュリン分泌能やβ細胞機能が改善していた。
3. Responder では皮下脂肪優位の肥満で、体重にかかわらず介入成功者の多くは内臓脂肪の減少が見られた。
4. 肝臓の脂肪は両者で変化なかった。
5. 慢性炎症を示す指標は responder、non-responder で差はなかったが、responder ではアディポネクチンのレベルが non-responder より高かった。
6. GLP-1、GIP分泌は両者で変化はなかったが、グルカゴンのレベルが responder で低下していることから、インクレチンに対する感受性が responder では改善している。
7. 遺伝的肥満リスクスコアに差はなかった。

以上が結果で、これまで考えられているように、皮下脂肪がついても、内臓脂肪の蓄積を防げれば糖代謝を正常に維持できる良い肥満と考えて良いという話だが、生活改善介入臨床研究から明らかになった点が面白い。

もう一つのフロリダ大学からの論文は、芸術の力を借りて病気を防げることをうたった研究論文を集めて調べ直したメタゲノム研究だが、記述的すぎてよくわからない点も多い。ただ、芸術の力を簡単に持ち出す話は多いので、その意味で面白い研究だ。タイトルは「The arts for disease prevention and health promotion: a systematic review（病気の予防と健康増進のための芸術：システミックレビュー）」だ。

この研究では芸術を健康増進や予防のために利用した結果を報告している論文を網羅的に集め、研究が科学的に行われたかどうかでフィルターをかけ残った6831編の論文を精査している。1992年から2024年までのほぼ30年に6800もの論文が健康と芸術の関わりについて発表されているのにまず驚く。

最終的には条件をクリアした95報に絞っているが、それでも解析は散漫で終わっており、結論らしい結論は出ずに、著者らの感想が書かれているといった具合だ。実際、芸術といっても、ビジュアルアート、音楽、ダンス、劇、文学まで含んでおり、それぞれ人間に対する影響は異なるはずで、アートと一言で片付けるのは乱暴に思える。

また、介入した対象集団も多様だが、どうしても貧困などの問題を抱えている集団が対象になりやすい。また多くの論文では最初からアートの効果を考えるわけではなく、貧困層の健康を守るためのリテラシーを上げるためのシンボルとして使われているケースが多い。例えばみんなで合唱しようといった運動のイメージだ。

結局明確な結論はなく、最後は著者の印象として、ほとんどの研究で芸術は文化活動に参加することで対象となった人々の身体的活動を高め、また人と人とが混じり合える機会を作るために用いられており、芸術自体の力というわけではないと結論している。わかりにくい研究でよく採択されたと思うが、ともすると芸術自体の力を信じてしまうが、それに対する批判的な取り組みとして見ると面白い。

オステオポンチンはbone biologyではよく知られた分泌分子で、石灰化を抑え、破骨細胞活性化による骨吸収を高めるなど、骨のリモデリングに関わる分子として知られてきた。ノックアウトマウスでは骨の発生に異常は認められず、骨吸収が抑えられ骨量増加が見られる程度だが、骨折時の修復の遅延等が報告されている。ただ、ノックアウトマウスの解析から、オステオポンチンが骨以外の様々な細胞で機能していることが明らかになった。

今日紹介する英国ガン研究所からの論文は、オステオポンチンが膵臓ガンの上皮間質転換を誘導し転移を促進することを示した論文で、膵臓ガンでは骨のリモデリングと使われている同じ分子セットが働いていることがわかる研究。9月24日 Nature にオンライン掲載された。タイトルは「SPP1 is required for maintaining mesenchymal cell fate in pancreatic cancer（膵臓ガンの間質細胞形質の維持に必要）」だ。

SPP1はオステオポンチンのことで、このような全く記号化された名前をわざわざタイトルに使うことで読んでみようとする人の数が減るのではないかと心配する。私も「SPP1とは何ぞや」と調べた結果、オステオポンチンと知って急に興味がわいた。

全く知らなかったが、膵臓ガンが進行すると血中のオステオポンチンが上昇するすることが知られていたらしい。この上昇が膵臓ガンの悪性度と関係があるのか調べるために、single cell レベルで遺伝子発現を調べ、オステオポンチンの発現と上皮が間質細胞のように変化するEMTが強く相関していることがわかる。ただ、間葉系に変化した細胞がオステオポンチンを分泌するのではなく、上皮タイプの細胞から分泌される。

ガン細胞からオステオポンチン遺伝子をノックアウトすると、間質系の形態をとる細胞が消失することから、上皮からのオステオポンチン分泌が間葉系へ転換したガンを維持していることがわかる。また発ガン後オステオポンチン遺伝子をノックアウトすると、転移が強く抑制される。異常のことから、膵臓ガンは様々な刺激で間質系細胞への転換が起こり転移しやすくなるが、間葉系細胞は上皮からのオステオポンチンに依存して増殖維持されていることが明らかになった。

そこで、上皮から分泌されたオステオポンチンが間質系細胞に作用するメカニズムを、上流から下流まで詳しく調べ、

1. 膵臓ガンの場合オステオポンチンはインテグリンβ3を受容体としてシグナルを伝える。
2. 膵臓ガンのオルガノイド培養で、オステオポンチン刺激によりBMP2とその阻害分子Grem1が誘導される。BMP2はインテグリンの直接の下流で誘導されるが、Grem1は誘導されたBMP2により誘導される。
3. インテグリンの刺激はNFκBシグナル経路を介してBMP2を誘導する。

以上が結果で、BMP2は snail、slug、twist 等を誘導してガンの上皮間質転換を誘導することは知られていたが、膵臓ガンではその上流にオステオポンチンが存在したことになる。そして、骨の細胞と同じように、BMP2は同時に自らの阻害剤であるGrem1の誘導を刺激することで、間質系転換への絶妙バランスを誘導することになる。

この3者によるバランスは、例えばGrem1をノックアウトしておくと、オステオポンチンをノックアウトしても間質系転換した細胞はそのまま維持される。逆にオステオポンチンを過剰発現させて誘導される強い間質系細胞への転換は、Grem1を過剰発現させると抑えられる。このようにBMP2を真ん中に3者がバランスを形成することで、膵臓ガンの上皮間質系転換が調節されていることがわかる。

研究としては特に驚くほどではないと思うが、膵臓ガンがオステオポンチン、BMP2、そしてGrem1という骨のリモデリングの三種の神器をそのまま使って、より悪性の転移しやすい細胞を作っているという類似性には驚いた。

CAR-Tは抗原特異性をデザインできるガン免疫として実際に臨床で大きな成果を挙げているが、まだまだ万能ではない。ガンに発現する同じ抗原に対するキメラ抗原受容体 (CAR) を導入した細胞を移植しても、結果はまちまちで、その理由がわからないことが多い。そこで、CAR-Tの遺伝子改変で、より効果の高いCAR-Tを誘導するためのチャレンジが進んでいる。

9月24日 Nature にオンライン掲載された論文の中に、2報のクリスパースクリーニングを用いてCAR-Tの機能に影響を及ぼす遺伝子を網羅的にリストする試みを見かけたので、まとめて紹介する。方法も結果も違うのだが、今回はハーバード大学からの論文を中心に紹介する。タイトルは「In vivo CRISPR screens identify modifiers of CAR T cell function in myeloma（生体内でのCRISPRスクリーニングにより骨髄腫に対するCAR-T機能のモディファイアーが見つかる）」だ。

人間の骨髄腫株を移植した免疫不全マウスに、これに対するCAR-Tを注射して、21日目の移植細胞を採取しゲノムを調べるのだが、マウスに注射する前にクリスパーを用いて機能に影響するのではと考えた1180種類の遺伝子をノックアウトしておき、21目に採取したCAR-Tでどの遺伝子がノックアウトされると、増殖維持されやすくなるかを調べている。

この方法で、いくつかの遺伝子がノックアウトによりCAR-Tを長続きさせるとしてリストされてくる。もちろん遺伝子がノックアウトされるとCAR-Tとして全く維持できなくなる遺伝子も存在し、例えばサイトカイン刺激に関わるSTAT3やIL2受容体αは時間がたつと細胞集団から消えてしまう。一方、CAR-Tを長続きさせる遺伝子はノックアウトされると集団の中で数が増えてくる。

この研究ではノックアウトによりはっきりと効果が見られた遺伝子としてRASの活性化に関わるRASA2、サイトカインシグナルを抑える脱リン酸化酵素PTPN2、そして細胞周期の抑制に関わるCDKN1B（p27のこと）がリストされた。

そこでそれぞれを別々にノックアウトしたCAR-Tを作成し、抗腫瘍効果を調べるとCDKN1BノックアウトCAR-Tが最も高いキラー活性を示し、しかも長期にガンを抑制することができた。一方、他の2つの遺伝子では効果は見られるものの、長続きしないことがわかった。

メカニズムを調べると、予想通り細胞周期の抑制が低下するため、細胞の増殖が高いレベルで維持されるが、それだけではなくCD8キラー細胞への誘導も強く、結果として抗ガン作用の強い細胞を誘導して増殖させられることを示している。

とすると今度はCAR-Tがガンになってしまうのではと心配するが、基本的にはガンの刺激が存在するときだけ細胞の増殖が維持されること、更にはこれまでのCAR-T治療で発生した腫瘍性細胞でCDKN1Bが欠損した細胞が見つかっていないことを挙げている。最近では自殺遺伝子を組み込むことも可能なので、トライする価値はある。

もう一編の論文はウィーンの分子医学研究所からの論文だが、クリスパースクリーニングから実際の臨床応用までシステミックに行えるよく考えられた方法が提案されている。ただ驚くのは、それぞれの研究が標的にしている細胞がハーバードは骨髄腫、分子医学研究所は白血病という差はあるのだが、発見された遺伝子のオーバーラップは少なく、この研究ではGタンパク質の一つRHOGと細胞死遺伝子FASで、FASとRHOGをノックアウトしたCAR-Tは腫瘍抑制効果がかなり高くなることが示されている。

ざっと見た感じ、やってみてもいいかと思うのはハーバードのCDKN1Bだが、要するに一度で全ての答えが出るわけではなく、このような試みを繰り返す中で最強で安全なCAR-Tが生まれてくるのだと思う。

長寿の研究での線虫の貢献は大きい。寿命が20日ぐらいと短く、寿命自体を形質として研究しやすい。その結果ダイエットが長寿の秘訣であること、一般の人の注目が高いサーチュインと寿命の関係などは線虫で明らかにされた。

前者は代謝、後者はエピジェネティックスと寿命の関係を明らかにした研究だが、今日紹介するベーラー医科大学からの論文は、代謝とエピジェネティックスが、「風が吹いたら桶屋が儲かる」で語られるような複雑な経路を経て子孫の寿命を伸ばせることを示した研究で、9月25日 Science に掲載された。タイトルは「Lysosomes signal through the epigenome to regulate longevity across generations（リソゾームのシグナルはエピゲノムを通して世代を超えて寿命を調節する）」だ。

食制限により線虫の寿命が延びることがわかっており、基本的には全身の細胞の代謝の問題だが、食制限に対する最初の組織反応は消化管上皮でのリソゾーム局在リパーゼ様タンパク質4 (LL4) が誘導され、これも寿命に関わるAMPKやmTORを抑制して長寿に貢献することがこれまでの仕事で知られている。この研究は食制限の代わりに、腸管でLL4が過剰発現する線虫を作成し、その子孫を見ていくと、導入遺伝子を持っていない子孫線虫も寿命が延びることを発見している。即ち、腸に発現したLL4によって子孫の遺伝子のエピゲノムが変化し長寿になるという予想外の現象が起こった。

子孫線虫に伝わるエピジェネティック現象なので、まずLL4により腸管で起こるエピジェネティック調節分子の発現と、その子孫寿命への効果を調べ、LL4によりヒストンバリアントの一つ his71 が腸管で誘導されることが、子孫の寿命を延ばすことを発見する。しかし腸管で起こった変化が子孫に伝わるためには、生殖細胞へとこの変化が伝わる必要がある。そこで、腸管で作られる his71 をラベルして生殖細胞への移行がないかを調べ、期待通り腸管から生殖細胞へ腸管のリポプロテインによって伝達されることがわかった。即ち、腸管で発生したヒストンバリアントが生殖細胞まで伝達され、生殖細胞のエピゲノムを変化させることがわかった。この時、生殖細胞だけで働いているメチル化酵素 Dot1.3 により his71 ヒストンバリアントのK79がメチル化され、これが長寿に関わる遺伝子のエピジェネティックスを変化させ、子孫の寿命を延ばしている。

最後に、腸管上皮でLL4、更には食制限で his71 が誘導される分子メカニズムについて詳しく解析し、Rasファミリー分子によりAMPKがリソゾームにリクルートされ、mTORシグナルを抑制しこれが細胞レベルの長寿を誘導するとともに、SNK-1転写因子依存的にhis71を誘導することも明らかになった。また腸管上皮自体でLL4が活性化されるだけでも、個体の寿命は少し延びることを明らかにし、全身の代謝に先駆けて腸上皮の飢餓への適応が長寿をもたらすことも示している。

結果は以上で、飢餓によりLL4が発現し、腸上皮を介する長寿に貢献するとともに、転写されてくるヒストンバリアントを生殖細胞に伝えることで、次世代の長寿をエピジェネティックな機構を介して実現するという、ややこしい回路だがなかなかよくできたシステムができている。これが他の動物でも起こる可能性があるのかどうかは全くわからないが、飢餓に対する極めて合目的な対応だと感心した。

ガンマーカーとして利用されている多くの抗原が糖鎖抗原であることはよく知られた事実だ。しかし、多くの糖鎖ガンマーカーはガンで急速に上昇するとは言え完全にガン特異的とは言えず、これをガン免疫抗原として利用するというアイデアはこれまで成功していない。

これに対して今日紹介するカリフォルニア大学アーバイン校からの論文は、糖鎖に結合するレクチンとT細胞受容体CD3に対する抗体を合体させたキメラ抗体を用いると、ひょっとしたら多くのガンに効果が見られる免疫治療が開発できる可能性を示した研究で、9月25日 Cell にオンライン掲載された。タイトルは「Safe immunosuppression-resistant pan-cancer immunotherapeutics by velcro-like density-dependent targeting of tumor-associated carbohydrate antigens（免疫抑制に抵抗性があり安全なガン横断的免疫治療が腫瘍表面にベルクロのような高い密度で存在する腫瘍糖鎖により可能になる）」だ。

腫瘍を電子顕微鏡で見るとNグリカンやOグリカンがあたかもベルクロのようにびっしりと発現され接着を維持している。これを見ると、少々特異性の問題はあっても腫瘍免疫に利用できるのではと思う。そこで濃度の調節しやすいレクチン/抗CD3キメラ抗体 (GlyTR1) を用いて、レクチンでまずガンに結合し、その細胞へT細胞をリクルートしてT細胞のキラー活性や炎症反応を誘導する方法に絞って開発している。

まず取り上げたレクチンは、昔の免疫学者なら皆知っているフィトヘムグルチニン (PHA) で、そのうちの一つL-PHAだ。なぜフィトヘムグルチニンというかというと、白血球を凝集させるからで、これによりT細胞の増殖を誘導でき、昔は刺激に使っていたことがある。即ち白血球などにも発現しているのにこれを使おうとしたのは驚きだが、凝集してしまったGlyTR1を除くことで、PHAでT細胞に結合して凝集させる心配なくGlyTR1を使えることを確認している。その上で、いくつかのガンでGlyTR1とCD8を一緒に混ぜると、ガンに対するキラー活性が得られることを示している。

もう一つ取り上げたレクチンは我々の遺伝子にコードされているCD301で、これを使うことで外来抗原への免疫の心配はなくなる。ただ、遺伝子発現が簡単ではなく、様々な遺伝子操作を加えてようやくCD3014分子とCD3抗体が繋がったGlyTR2を完成させている。そして赤血球など予想される結合がほとんど無視できることを確認して、CD8T細胞と共培養することでトリプルネガティブ乳ガンなどをガン特異的に抑制できることを示している。

あとは使えるガンのレパートリーを調べ、基本的にはGlyTR1の方がGlyTR2より活性が強いこと、しかしどちらもトリプルネガティブ乳ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、膵臓ガン、大腸ガン、非小細胞性肺ガン、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、そしてT細胞性白血病の全てに活性があることを明らかにしている。

次に、免疫系をヒト化したマウスに腫瘍を移植、生体内でこの方法でガンを抑制できるか膵臓ガンとトリプルネガティブ乳ガンで調べ、強い抑制効果を示すことを明らかにしている。

最後に取り出した腫瘍をCD8T細胞とゲル内に埋め込む方法を開発し、ユーイング腫瘍の転移巣から腫瘍塊を取り出し、GlyTR1とCD8T細胞と一緒に培養することで腫瘍が完全に消失することを確認している。

ただマウスを用いる実験系では最終的な安全性は証明できない。従って、今後人間での安全性をしらべる必要性があるが、PHAはチェックポイント阻害薬として人間に使われた経験もあり、うまくドーズを選べば臨床に応用できるのではと締めくくっている。

誰もが難しいと思っていたことを、最適の方法を用いてここまでやり遂げたことが重要で、個人的にも十分可能性はあると思っている。

黄熱病やデング熱の媒介昆虫は言わずと知れたネッタイシマカで、温暖化に伴い我が国本州にも入ってきたのではと大騒ぎになったこともある。今日紹介する Verily Life Science という米国のヘルスベンチャーを中心とする国際チームが9月18日 Science に発表した論文は、世界中から集めたネッタイシマカの一種のゲノムプロジェクトで、人間のゲノムプロジェクトと同じように現在世界中で人類を悩ませているネッタイシマカの由来や移動の有様がよくわかる論文で、勉強になった。タイトルは「1206 genomes reveal origin and movement of Aedes aegypti driving increased dengue risk（現在世界で増加しているデング熱を媒介するネッタイシマカの由来と移動が1206個体のゲノムから明らかになった）」。

ネッタイシマカについては国際ゲノムプロジェクトが進んでおり、この論文もその一環として発表されている。最終的にこのプロジェクトだけで31テラベース、人間のゲノムを3ギガとすると、それだけで1万人分のゲノム解読量になる。

さて、これを読むまで全く知らなかったが現在のネッタイシマカは大きくforosus (万能型) とaegypti (人間型) に別れ、デングを媒介しているのは aegypti (AG) の方だ。これまでの研究でネッタイシマカは他の種から85000年前インドで分離し、その後アフリカ熱帯ジャングルで繁栄し、爬虫類を含むほとんどの血液を吸って生きる万能型として生きてきた。その後、人間が増えるに従って数千年前に人間型のプロトタイプ（プロト人間型）が生まれ、それが南米で人間型へ進化し、これが現在南米、アジアで猛威を振るうネッタイシマカであることが述べられている。

特にヒト型プロトタイプ以降のネッタイシマカゲノムは、人口が増え人の移動が増えるとともに、内部であるいは他の方と複雑な交雑を繰り返しているので、その影響を除いて系統樹を構築するのに結構手間取ったようだが、最終的にいくつかの可能性の中から、起原と移動についてのシナリオが完成しているので、詳細を省いてそれだけを紹介する。

まず現在の分布だが、人間型はほとんどアフリカには存在せず、アフリカでは今も万能型が優勢だ。ただ、西海岸ではプロト人型が、逆に東海岸ではほんの少し人型が存在している。

ゲノム系統樹から万能型からプロト人間型の進化が5000年前に起こるが、これは西海岸で人口が増えヒトへの感染がより容易になったことによる。その後何千年もこの状態が続き、アフリカ以外にはネッタイシマカは存在しなかった。そこに1800年代に入ってアフリカ西海岸から奴隷貿易が盛んになることで、プロト人間型がアメリカ大陸に上陸する。そうして増加する人間を栄養分として繁栄するが、その中で人間型が発生し、現在アルゼンチンで分離されているプロト人間型ネッタイシマカが南アメリカで拡大したプロト人間型でそこから人間型が分離したことがわかる。即ち、人間型のネッタイシマカは奴隷貿易が始まった後、プロト人間型が独自に進化した結果である事がわかる。

そして、この人間型は人間の移動とともにあっという間にアジア、オセアニアの熱帯地域に拡大している。

その結果、南アメリカではプロト人間型と人間型、そしてその間の交雑型が現在も維持されているが、アジアでは人間型だけが繁栄している。一方、アフリカでは西海岸の一部の地域を除くとプロト人間型は逆に存在せず、万能型と人間型が混在して存在している。これらは、人間の動きとともにそれぞれのタイプが持ち込まれ交雑を繰り返した結果である事がわかる。

その後特にアメリカでは積極的に撲滅が図られ、一時ネッタイシマカがほとんど存在しない時期があった。その後殺虫剤耐性株の出現などで、結局アメリカ大陸には一部の地域を除くと、アジアと同じで人間型だけが再拡大し、現在の状況が生まれている。これらは、殺虫剤への抵抗性遺伝子を追いかけることで、正確に跡づけることができる。その結果、アフリカへの人間型の持ち込みが今度は東海岸で見られるようになり、アメリカ、アフリカともにプロト人間型は一部の地域だけに限られることがわかった。

このようにたった200年程度の間に大きな変遷を、しかも人間ともに遂げているネッタイシマカは、今後の温暖化と人類の新しい移動のタイプ等の結果、これまでとは異なる変遷をと遂げる様な予感がする。それがどんな世界か、あまりいい予感はしない。