1月18日 FOPを理解するための重要な研究(1月12日 Science Signaling 掲載論文)
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1月18日 FOPを理解するための重要な研究(1月12日 Science Signaling 掲載論文)

2021年1月18日

AASJの二人の理事(藤本、麻生)と私は、全身に異所性の骨化が進む病気FOPを通して知り会った。その結果、FOPに関する重要な論文を見落とさない様常にプレッシャーがかかっている。その意味で、今日紹介するミシガン大学からの論文はFOPを理解する上で極めて重要な貢献ではないかと思う。タイトルは「Augmented BMP signaling commits cranial neural crest cells to a chondrogenic fate by suppressing autophagic β-catenin degradation (神経堤細胞でのBMPシグナルの更新はオートファジーによるβカテニン分解を抑えて軟骨への分化を誘導する)」で、1月12日号Science Signaling に掲載された。

少し余談になるが、この論文の責任著者の三品さんは、発生過程でのBMPシグナル研究の第一人者だが、所属がミシガン大学と知って驚いた。というのも、私の頭の中では、日本に戻って定着していると思っていた。結局彼にとって日本は研究し良い環境ではなく、おそらく最近ミシガン大学に移ったと思う。せっかくUターンしてくれた研究者が、また我が国を離れるという状況を見ると、今、問題になっている科学技術力低下の原因を見る様な気がした。

FOPはBMPシグナルを伝達するアクチビン受容体1(ACVR1)の突然変異による分子機能亢進によることははっきりしているが、なぜ発生過程では大きな異常が見られないのか、何が骨化の引き金になるのか、骨化するのは筋肉細胞そのものなのかなど、わからないことが多い。

三品さんたちは以前から、FOP変異をACVR1の活性化型の影響を調べる目的で研究してきた。今回は、この変異を神経堤細胞で発現する様にして調べたところ、FOPと同じ異所性の骨化が誘導できることを発見する。完全に同じとは言えないまでも、初めてFOPの動物モデルができたことになる。

シグナルを熟知した発生学者の仕事で、詳細は省くが、この骨化のメカニズムを追求する中で、神経堤細胞が鰓弓へ分化した後、様々な系列へとコミットする段階の初期にACVR1のシグナルが高まると、軟骨へと分化が誘導され、それが本来骨でないところに移動した後、骨に分化することを突き止める。

鰓弓細胞を培養してACVR1シグナルを抑える実験で、培養1日目には効果が見られるが、それ以降は全く効果がないことから、このシグナルは軟骨系への分化のコミットメント時のみ働くことがわかる。これは、FOP治療にとっても重要で、どの時期かわからないが、かなり早い段階でACVR1をピンポイントで抑えることの重要性を示唆している。

そして最後にFOP型ACVR1のシグナル伝達機構について解析し、ACVR1活性の亢進は、まずmTORの活性化を誘導し、これが鰓弓細胞の軟骨へのコミットメントに関わることを明らかにする。事実、現在iPS研究所でFOP治療にも使われているmTOR阻害剤は軟骨へのコミットメントを抑える活性がある。ただ、これも鰓弓細胞が分化決定する最初の段階だけで、後には全く効果がない。このことから、細胞分化系で特定される薬剤も、投与する時期が重要で、軟骨への分化決定がFOPでいつ起こったのかを再検討することが重要になる。

この研究ではmTORがなぜ軟骨形成を誘導するのかについても明らかにしている。様々なシグナル経路を調べた結果、mTOR活性化は、オートファジーを抑制し、オートファジーによりβカテニンの分解が抑えられて、Wntと同じ様にシグナルが入って、軟骨への分化が促進されることを明らかにしている。

この研究は盛り沢山で、発生過程での軟骨形成が、一般的に考えられているオーソドックスなBMPやWntシグナルだけでなく、両方がオートファジーを介してクロストークする微調整の支配下にあることを示しており、今後発生や疾患を考える上で新しい概念を提供している。

そして何よりも、FOPの成立機序について多くの示唆を与えている。これまで未分化細胞から骨細胞への分化を抑制する薬剤がiPS研究所の池谷さんたちにより特定されており、またACVR1の機能を特異的に抑制する薬剤も開発されている。この研究から、これらの薬剤は軟骨への分化決定過程にピンポイントで投与する必要があることが明らかになった。とすると、この感受性がFOP発症全過程のどの時期なのか明らかにすることが最も重要な課題になる。さらに、一旦コミットした軟骨が骨化する過程を標的にする重要性も明らかになった。

BMPシグナルと骨化というと、そのままわかった気になってしまうことが落とし穴で、この落とし穴から抜け出せたという意味で、三品さんたちの研究は重要だ。

カテゴリ:論文ウォッチ

1月17日 炎症は痛みを抑える(1月13日 Nature オンライン掲載論文)

2021年1月17日

「炎症は痛みを抑える」などと書くと、ほとんどの方は書き間違いだと思われるはずだ。というのもギリシャの昔から炎症はCalor(熱)、Rubor(発赤)、Tumor(腫れ)そしてDolor(痛み)を伴うものと決まっており、これを疑う人はなかった。しかし、炎症、特に自然炎症のメカニズムがわかってくると、なぜ痛みがインフラマゾームを活性化する炎症過程で誘導するのか明確に答えることは簡単でない。私の素人理解では、炎症による破壊組織から遊出される様々な分子が痛み受容体を刺激するためだろうと考えてきた。

今日紹介するデューク大学からの論文は、この意味で画期的で、自然炎症は実際には痛みを抑える働きがあるという、全く新しい可能性を示した研究で1月13日Natureにオンライン出版された。タイトルは「STING controls nociception via type I interferon signalling in sensory neurons (STING は痛み受容を感覚神経のインターフェロンシグナルを通してコントロールしている)」だ。

これまで抹消の痛み受容体刺激が中枢での免疫反応を誘導する過程は研究が進んでいたが、炎症自体が痛み受容体の機能に影響するかどうかについては研究されていなかったようだ、この研究では、自然免疫でインターフェロンが誘導される下流のシグナル分子STINGを髄腔内投与して脊髄の自然免疫系を活性化して、その時の様々な痛みに対する反応を調べている。

「炎症=痛み増幅」というこれまでの概念を覆し、ATING活性化は様々な痛みに対する閾値を上げて、痛みを軽減する。例えば、微小管形成阻害によるガン治療で見られる末梢神経障害やガン転移による骨の痛みまで、中枢でブロックしてくれる。逆に、STINGを阻害したり、あるいは STINGが欠損したマウスでは痛みの閾値が下がる。すなわち、STINGは炎症シグナルを受けて、常に神経の閾値を高めていることが明らかになった。

このメカニズムを探ると、神経系では炎症シグナルを受けたミクログリアでSTINGが活性化し、これにより1型インターフェロン(IFN)が分泌され、これが神経細胞でカルシウムやナトリウムチャンネルの量を調節して、痛み受容体の閾値を高めて、痛みを抑えていることがわかった。実際、IFNを髄腔内投与すると、痛みの閾値を上げて感受性を下げることができる。一方、神経細胞のIFN受容体をノックアウトするとこの効果はなくなる。

最後に猿を用いて同じ実験を行い、ADU-S100と名付けられたSTING活性化剤を髄腔に持続投与することで、IFN分泌が上がり、高い鎮痛効果を発揮することを示している。また、神経培養を用いて、同じ効果が人間でも得られることも示している。

結果は以上で、脊髄にカテーテルを用いて投与する必要があるが、新しいタイプの、しかも結構万能の鎮痛剤が開発できる可能性がある。ほぼ前臨床は終わっており、治験が行われるのもすぐではないかと期待される。

まさに炎症により痛みを抑える治療ができそうだが、これがギリシャ以来の炎症概念を損なうものでないことも申し添えた方がいいだろう。お分かりのように、これは全て中枢での話で、神経端末が存在する抹消では、おそらく炎症により痛み受容体が刺激されるというスキームは間違いがない。

しかし、IFNも痛み受容体も、外界からのストレス需要の鍵となる分子だが、これからは異なる細胞システムのストレスへの反応の統合を理解するための鍵になるように思う。

カテゴリ:論文ウォッチ

1月16日 Glutaminaseは老化研究のブレークスルーになるか(1月15日号 Science 掲載論文)

2021年1月16日

抗老化というと、老化細胞の生成を抑えて達成するものと一般には理解され、そのための様々なサプリメントが世に出回っている。しかし、これまで何度も紹介した様に(https://aasj.jp/news/watch/3057)、老化が始まった細胞を積極的に殺してしまうsenolysisが、個体を若返らせるためには最も有効な方法だと思っている。というのも、この方法で肺線維症や腎硬化症など、老化が早く進行してしまう病気を抑えることが証明されている。とはいえ、現在senolysisを誘導する方法としてはダサニチブの様なリン酸化阻害剤や、免疫システムを用いた細胞除去が必要で、どれも気軽に使える方法ではない。

今日は久しぶりに我が国からの論文、東大医科研の中西真さん達が1月15日号のScienceに発表した論文を紹介する。senolysisをグルタミン代謝を抑えることで実現できることを示した論文で、抗老化を実現する手法としては画期的な研究だと思う。タイトルは「Senolysis by glutaminolysis inhibition ameliorates various age-associated disorders(グルタミン分解阻害によるsenolysisは様々な老化に伴う異常を軽減する)」だ。

この研究ではp53を活性化して老化を誘導した線維芽細胞の遺伝子発現と遺伝子ノックダウン解析から、細胞老化で細胞内のアシドーシスが起こると、mRNAの安定化を通してglutaminase1(GLS)の発現が高まること、また老化細胞が生存するためにはGLSが必須で、酵素活性を阻害すると老化細胞の細胞死を誘導できることを発見する。すなわち、senolysisをグルタミン代謝系の操作で実現できることが明らかになった。

そして、グルタミン分解抑制による細胞死のメカニズムを様々な角度から調べ、最終的に酸性に傾く細胞質のpHを中和するためにグルタミン分解が行われると結論している。また老化細胞はリソゾーム膜が障害されることでアシドーシスに陥りやすく、またアシドーシスが続くとミトコンドリア膜上のPTPが開いて細胞死が誘導されるため、これを防ごうとglutaminase活性が高まり、アシドーシスを中和して細胞をなんとか生存させていることを示している。慢性炎症も含め、様々な細胞ストレスが老化につながることを十分納得させるシナリオだと思う。

最後に、GLNの発現が、確かにマウス体内の老化細胞で高く、阻害剤を老化マウスに投与する実験を行い、腎硬化症や肺線維症を改善するなど、様々な老化に関連する異常を防ぐとともに、いわゆる慢性炎症をおさえる効果があることを示している。

結果は以上で、senolysisを代謝調節から実現できることを示した点で画期的だと思う。グルタミン代謝は、ガン制圧も含めて様々な方面で研究されており、多くの阻害剤も開発されている。また、アシドーシスとそれによるミトコンドリア膜PTPを介する細胞死という下流の経路も明らかにしている点も、今後新しい抗老化剤開発に寄与する様に感じる。いずれにせよ、senolysisをより身近に感じさせてくれる優れた研究だと感心した。

ずいぶん昔になるが中西さんが名古屋市立大学医学部に在籍の頃「DNAメチル化と細胞周期:プロの仕事」と紹介したことがある(https://aasj.jp/news/watch/489)。今回もプロの仕事が発揮されたと思う。

カテゴリ:論文ウォッチ

1月15日 Aphantasia:心的イメージ欠損症(Cortex 1月号 掲載論文)

2021年1月15日

何回か紹介したと思うが、今「Art Meets Science 学生プロジェクト」(https://www.facebook.com/artsmeetsscience/)のお手伝いをしている。リモートになってから関西からも参加しやすくなり、定例のミーティングでは、芸術に関する脳科学論文を紹介する役割をいただいて、張り切ってやっている。特に東京藝大の学生さんとの交流は新鮮で、様々な新しい問題を考える機会になる。先日述べた「脳で触る」プロジェクトから考え直してみたクオリア問題(https://aasj.jp/news/watch/14623)もそうだが、音楽でも美術でも、感覚の鋭さ以上に、豊かな心的イメージを形成する能力が問われる様に思う。

そんなわけで、最近は心的イメージに関わる論文を特に気をつけて探す様になったが、そんな時、今日紹介するシカゴ大学からの論文を見つけた。タイトルは「Quantifying aphantasia through drawing: Those without visual imagery show deficits in object but not spatial memory (Aphantasiaを定量化する:視覚的イメージが欠損した人は空間記憶は正常だが、物の記憶が障害されている)」だ。

このタイトルを見たとき、まずAphantasiaという初めての言葉に釘付けになった。ファンタジアがない。そしてこれが視覚的イメージを呼び起こせない人のことだとわかった。要するに、心的イメージ形成がうまくいかないとすると、芸術的創造性の対極を意味する。

そこでまずAphantasiaをPubMedで調べると、まだ関連する論文は15報しか上がってこない。現時点のcovid-19論文92553報と比べると、認知0と言っていいだろう。幸いこの15報の中にあるオーストラリア・South-Wales大学のPearsonが2019年にNature Reviews Neurosciences に発表した総説はAphantasiaを理解するには最適だと思う。

これによるとAphantasiaとは、何かを頭の中でイメージすることができない人を意味し、1880年Galtonにより最初に指摘された。

「多くは、先天的なもので、物を思い描くことが難しいことを自覚はしていても、日常生活には全く影響がない。これまでは自覚的な症状を診断するための、VVIQやOSIQなどの問診基準で診断されてきたが、残念ながら脳波やMRIといった診断手段ではまだはっきりした定義はできていない。唯一、それぞれの目に異なるイメージを提示してどちらが見えるかを問う、心的イメージによるバイアスを調べると、Aphantasiaの人は先にイメージのバイアスを与えても、影響されにくいことから、客観的な指標で診断が可能である」などが述べられている。

今日紹介するシカゴ大学の論文は、Aphantasiaを診断するための新しい方法の模索で、これまで問診からAphantasiaと診断された人たちと、コントロール群をウェッブで集め、写真を見せたあと思い出して描くという課題と、同じ写真を見ながら描くという課題を与えて、描かれた絵を分析し、Aphantasiaの特徴を調べている。

ある程度Aphantasiaの知識があると納得の結果で、次の様にまとめられる。

  • Aphantasiaは現在VVIQ,OSIQで診断されているが、この診断法を使うと正常と明確に分離が可能で信頼できる。
  • 絵を見ながら描く能力は正常と変わらないが、思い出して描くとき描けるものの数が大幅に減る。しかし、それぞれの配置、すなわち空間記憶は正常。
  • 思い起こすものの数は少ないが、正常より間違いは少ない。
  • 記憶を描くとき文字での説明を許可すると、正常人と比べて多くの文字やシンボルによる説明を用いる。

すなわち、Aphantasiaでは空間と物の記憶が分離していること、それをカバーするためにシンボルに頼るという構造が見えてくる。先にはっきりした脳生理学的定義はないといったが、心的イメージの形成には様々な脳領域に記憶されている部分を選択、統合した後、1次視覚野に再投射する過程が存在することが知られており、今回の結果、特に空間記憶と物記憶の分離と、イメージとシンボルとの関係を手がかりに脳生理学的研究が進む気がする。

ただ、論文を読んでいて、自分自身も言語や文字に頼る頭でっかちになって、心的イメージ形成能力が失われていることもよくわかった。実際、思い出して言語的に述べるのは得意だが、ビビッドなイメージとして示すのは苦手だ。とすると、失読症でも見られる様に、私たちの脳では、イメージとシンボルが常に鬩ぎ合っている様に思う。その意味で、科学の学生と芸術の学生の出会いは重要だと思う。

カテゴリ:論文ウォッチ

1月14日 ガンもDiapauseに入る(1月7日号 Cell 掲載論文)

2021年1月14日

Diapauseという言葉をご存知だろうか。Wikipediaで見ると、”delay in development in response to regularly and recurring periods of adverse environmental condition” と定義しており、基本的には発生途中で環境が悪化したとき、改善するまで発生が止まることを意味する。

実はこの言葉はES細胞を利用したことのある研究者には馴染みが深い。というのも、ES細胞の維持に必須で発生にも絶対必要だと思っていたLIFを欠損したマウスを作成しても、特に発生に異常は起こらないのだが、マウスをストレス下に置いたときに起こるDiapauseがうまく起こらないため、胎児が流産するというAustin Smith 達の論文に驚いた経験があるからだ。もちろんストレスが去れば、そのまま発生は再開される。

このdiapauseがガンでも起こっていることを示したのが今日紹介するトロント大学からの論文で1月7日号Cellに掲載された。タイトルは「Colorectal Cancer Cells Enter a Diapause-like DTP State to Survive Chemotherapy (大腸癌細胞は化学療法に耐えるためにdiapauseの様な薬剤耐性段階に入る)」だ。

この研究は、患者さんの大腸癌を免疫不全マウスに移植して増殖を調べる実験系で一般的に用いられる化学療法を行い、化学療法抵抗性のガン細胞が発生するメカニズムを調べるという、方法論としてはこれまで何度も用いられた、特に新味のない研究と言える。

ただこれまでこの様な研究から示されたのは、ガンの幹細胞モデルと呼ばれる考え方で、未熟な増殖しない幹細胞は薬剤耐性で、この段階で薬剤感受性が失われた新しい変異細胞が生まれ、増殖を始めることでガンが再発すると考えるモデルだ。

この研究ではイリノテカンを含む化学療法に対する大腸癌の反応を調べるうちに、治療初期段階で見られる耐性細胞は、幹細胞といった特殊な段階に集約されるのではなく、多様な細胞が一時休眠をしている可能性に気づいている。すなわち、幹細胞に集約する階層的なモデルではなく、全てのガン細胞が化学療法に対して一時的に休眠状態に入る、すなわちdiapauseモデルが起こっていることになる。

これを確かめるため、それぞれのガン細胞にレトロウイルスでバーコードを挿入し、化学療法による休眠で、バーコードの多様性が維持されるか調べている。もし幹細胞モデルなら、特定のバーコードに集約することが考えられる。答えは期待通りで、バーコードの多様性は化学療法によっても維持されることがわかった。すなわち、全ての多様な細胞がそのまま休眠期に入る。

後は休眠期のガン細胞の遺伝子発現を調べ、マウス胚盤胞期におこるdiapauseと同じ様な遺伝子発現プロファイルが見られることを示して、これが確かにdiapauseに対応する状態であることを確認している。

最後はメカニズムだが、例えば胚盤胞期のLIFの様な因子は残念ながら見つかっておらず、何がスイッチを入れるのかについては明らかでない。ただ、胚と同じで、mTOR経路が抑制され、代謝から増殖まで様々な分子の発現が低下していること、逆にこれを埋めるためのオートファジー機構が亢進していることを明らかにしている。また、mTOR阻害剤で同じ様にdiapause状態を誘導できることから、おそらくこの上流にある何かがガンのdiapauseのスイッチを入れているのだろう。実際、様々な癌で、化学療法を行うとdiapauseの遺伝子発現スコアが高まることも示しているが、スイッチは明確にはなっていない。

話はこれだけだが、もし多くのガンでdiapauseが治療初期に見られ、これがガンの薬剤耐性に関わるなら、この時期のdiapauseを抑制する方法の開発は、化学療法の効果をさらに高めると期待できる。この研究では、オートファジーの抑制がその鍵になると示唆しているが、これまでの研究を見るとこれだけでは足りないだろう。是非diapause自体のシグナルを見つけて、新しい治療法につなげてほしい。ひょっとしたらLIF?

カテゴリ:論文ウォッチ

1月13日 生姜が血管炎に効く?(12月29日 JCI Insight オンライン掲載論文)

2021年1月13日

この前zoomで中学校の同窓会をしていたら、茶カテキンが新型コロナウイルスに効果があることを産経で読んだので、感染予防目的で飲んでいると聞いて驚いた(飲むこと自体に問題はないが)。これは大阪府の吉村知事がポピドンヨードでうがいすれば重症化が防げると言って批判の的になったのと同じで、口内のウイルスを減らすということと、気道を通した感染による肺炎を単純に結びつけたことに間違いがある。もし本当に臨床効果があれば、間違いなく全国の待機感染者に勧められているだろう。メディアが断片を結び付けて、素人を騙している典型で、最後は記者発表した大学のせいにして後は知らん顔なのだろう。

ただ、口内のウイルス量を減らす効果があれば、ヨードもカテキンも捨てたものではない。すなわち、他の人にウイルスを感染させる最大の原因は唾液由来の飛沫だとすると、人と会う前にうがいをしたりお茶を飲んでウイルスが減るなら、完全とは思はないが、うつさないという点では少しは効果があるだろう。とすると「他の人に感染させない」という思いやりの心を強調して記者発表したり、報道することが必要だと思う。

今日紹介するワシントン大学からの論文は、一種の民間療法も、科学的に検証し、使い方まで明示すれば、立派な医学になることを示した研究で、少し軽めの論文紹介として取り上げることにした。タイトルは「Anti-neutrophil properties of natural gingerols in models of lupus(自然のgingerolが示すループスマウスモデルでの抗好中球活性)」で、JCI Insightというレッキとした医学雑誌に12月29日オンライン出版された。

この研究は生姜のエキスが炎症を抑える効果があるという民間療法からスタートしている。研究自体は、生姜から分離したgingerolと呼ばれる有機化合物が、白血球の炎症による血管炎を防止して、SLEの様な自己免疫性の血管炎を抑えるはずだという仮説に基づいている。

これを確かめるために、以前紹介した白血球がパンクする現象NETosis(https://aasj.jp/news/watch/14242)をエンドトキシン処理などで誘導し、gingerolがNEtosisを抑制できるか調べ、10μM程度で強く抑制できることを示している。

次に、この効果の作用機序を調べ、活性酸素産生が抑制されること、そしてこれらの変化は、Phosphodiestraseを阻害することでcAMPの濃度が高まることによる結果であることを示している。

作用機序はここまでで、後はTLR7を刺激する物質を皮膚に塗布し続けることで誘導される自己免疫性の血管炎を抑制する実験を行い、

  • gingerol腹腔内投与によりNEtosisを体内でほぼ完全に抑えること、
  • 全身性の自己免疫反応の結果起こる、抗DNA抗体などの自己抗体の出現を抑えられること、
  • 自己抗体による血栓形成を抑えられること、
  • 同じ効果は、phosphodiesterase阻害剤rolipramでも得られる。

ことを示している。すなわち、生姜エキスが白血球の炎症を抑えることで、ループス型の自己免疫病を抑えることができるという結果だ。

論文としてはこれだけで、古典的な薬理実験と言える。ただ好感が持てるのは、一般的に生姜サプリに用いられている量でこの実験を行っていること、経口で投与しても血中に到達できることなどを議論した後、それでも薬剤として使うのではなく、サプリメントとしてリスクを下げる方向で治験を行う方向を示している点だ。最終的には治験が終わって初めて評価ができるので、アウトカムを明示した治験を目指すという点が重要だ。

最後に個人的な印象を述べておくが、戯言と受け取ってほしい。ここで扱われた、NEtosis、抗phospholipid自己抗体による血管炎、血栓症などは、まさに新型コロナの重症化因子になっている点だ。その意味で、重症化防止のための治験を計画してもいい様な気がした。

カテゴリ:論文ウォッチ

1月12日 CRISPR/Casシステムのself-feedback機構(2月4日発行予定 Cell 掲載論文)

2021年1月12日

CRISPR/CasについてのCharpentierとDoudnaさんの業績がノーベル賞に値することは誰も異論がないが、ノーベル化学賞と聞いて驚いた人も多いと思う。事実、医学生物学に対する彼らの貢献は大きく、折しもタラセミアや鎌形赤血球症のCRISPR/Casを用いた治療が昨年の10大ニュースに選ばれた。当然医学生理学賞を頭に描くのが道理だ。

しかし、受賞理由を読んでみると、化学賞がふさわしいというより、今この2人だけにノーベル賞を授与するとするなら化学賞しかないということが伝わってきた。というのも、生物学としてCRISPR/Casシステムの発見は重要だし、また遺伝子操作技術としての未来は計り知れない。ただ、ここには多くの科学者が関わっており、誰を選ぶのか難しいし、文句も出そうだ。

そこで、元々crRNAとtracrRNAが結合してCasに認識されるガイドが形成されるという生物学を、crRNAとtracrRNAをキメラにして一本のガイドRNAにまとめることで、配列特異的遺伝子操作をプログラムできるとした2人の初めてのScience共著論文(図)をノーベル化学賞の対象にすることで、この2人以外を排除した絶妙の判断だった様に思える。

しかし、技術としてまとめられたシステムだけを見ると、失うものも多い。すなわち、CRISPR/Casシステムは、本来機能しているバクテリアの中でこそ面白い。

今日紹介するジョンズ・ホプキンス大学からの論文はtracrRNAの一つで最も長いものが、Cas9と結合してCRISPR/Casシステム全体の転写を調節することを示した研究で2月4日号のCellに掲載予定だ。タイトルは「A natural single-guide RNA repurposes Cas9 to autoregulate CRISPR-Cas expression (自然の一本鎖ガイドRNAはCas9をCRISPR/Cas発現の自己調節に使い回す)」だ。

このグループはCRISPR/Casシステム全体をプラスミドに導入して、このシステムが存在しないバクテリアを用いて、システム全体の発現レベルを決めるメカニズムを探っていたようだ。トランスポゾンにより変異を誘導して細菌のウイルス感受性に影響する分子を探索した結果、なんと最も高い影響が見られたのが、トランスポゾンがcrRNAと結合してCas9と結合して働くパートナーのtracrRNAに飛び込んだ時だったことを発見する。そして解析を進めて、tracrRNAをコードする領域から転写される最も長いtracrRNA(tra-L)が欠損すると、CRISPR/Casシステム全体の転写が高まることを明らかにする。このことは、CRISPR/Casシステム自体から転写されるRNAがCRISPR/Casの発現を抑えていることを示している。

さらにtra-LはCRISPR/Casシステムにコードされる全ての分子の発現を抑制しており、これにより新しい外来DNAをクリスパーアレーに組み込む活性も低下する。

次にメカニズムについて検討し、このtra-Lは、crRNAのパートナーとして働くtracrRNAだけでなく、もともとcrRNAが持っているtracrRNAとの相補配列も持っており、現在使われているキメラ型ガイドRNAにそっくりな構造を取れることが明らかになった。さらに驚くことに、これに続いてCRISPR/Cas転写を調節するプロモーター領域と相補的な10塩基対がつながっている。

このことは、tra-Lはそれ自身でガイドRNAとしてCas9と結合し、しかもCRISPR/Casのプロモーター領域にCas9をリクルートすることを示している。言ってみれば、CharpentierさんとDoudnaさんが構想したキメラガイドRNAが、実際には自然に存在していたことになる。とすると、Cas9でCRISPR/Cas領域が切断される心配があるが、Cas9のDNA切断活性には16塩基対以上の相補配列が必要で、10塩基の相補配列では切断する代わりにCas9は転写のリプレッサーとして働く。その結果、CRISPR/Casシステム全体のリプレッサーとしてCas9が使われ、self-feedbackがかかる様になっている。

さらにTra-Lが独立したガイドとしてCas9に結合することは、本来のcrRNA/tracrRNAガイドと競合することを意味する。実際、外来遺伝子がスペーサーとして組み込まれたCRISPRアレーが存在しないと、tra-Lによる転写抑制が強くなる。すなわち、外来遺伝子に対応する必要がないときは、CRISPR/Casシステム全体の転写を抑えていることがわかるが、外来DNAの侵入と戦うためcrRNAが働いているときには、Cas9のリプレッサーとしての役割は抑えられる。

ではなぜこの様なシステムが必要なのか、tra-Lの機能をノックアウトした細菌を用いて調べると、24時間以降増殖が低下することがわかる。すなわち、tra-Lが働かなくなると、CRISPR/Casシステムの転写が上がり、外来因子に対する免疫能力は上昇するが、その結果自己のDNA をスペーサーとして組み込んで、自己のゲノムを切断することで、増殖が止まることになる。すなわち、CRISPR/Casシステムが自己に対する免疫に働かないように活性を落とす一つのメカニズムになっていることがわかる。

最後に、この様なtra-Lは2型CRISPR/Casシステムの半分に存在し、進化的にもよく保存されていることも示している。

元免疫学者から見ると、T細胞をエフェクターと制御の両方に使って、免疫の促進と自己免疫の抑制を調節している免疫システムと重なる極めて巧妙なメカニズムだ。システムは生物全体の中で見るのが一番面白い典型といえる研究だ。とはいえ、ここから新しい技術も生まれるだろう。新しいガイドが見つかったわけで、遺伝子切断ではなく遺伝子調節に直接使える可能性もある。大いに期待したい。

カテゴリ:論文ウォッチ

1月11日 志賀毒素による炎症の抑制(11月27日 Science Immunology オンライン掲載論文)

2021年1月11日

以前紹介したCovid-19による呼吸不全を肺移植で治療した3例(https://aasj.jp/news/watch/14541)では、ウイルスは抗体やレムデシビルにより完全にコントロールされているのに呼吸不全は進行してしまっている。すなわち、ウイルス性の急性呼吸逼迫症(ARDS)がどこかの時点で内因性の炎症を誘導して間質肺炎や全身の血管炎が進むことになる。ただ、これをサイトカインストームという一言で語ってしまうと、分かった気にはなっても、本当の理解にはつながらない。というのも、現在知られている炎症の経路はあまりに複雑で、外因性ではじまっても、すぐに自己組織型の内因性の炎症へ移行する。その上、このスイッチはそれぞれの病原体で入り方が異なる。というのも、ウイルス自体、内因性に細胞が持っている炎症システムをいかに抑えるか、多様なメカニズムを持っている。新型コロナウイルスの場合、リボゾームでの翻訳抑制、スプライシングの阻害、タンパク質輸送の阻害で最初のインターフェロンなどの合成阻害、さらに外側からのインターフェロン刺激も、シグナルの抑制を介して徹底的に逃れる仕組みを持っている。すなわち普通考えられない様な自然免疫システムが作られたところに、これで抑制できない炎症シグナルだけが過剰に入ってくることになる。病原体ごとに自律的炎症スイッチの入り方が違っているとすると、この過程をなんとか理解して論理的に重症化を防ぎたいと思うのは当然だ。

そんなことを考えながら、異なる病原体がどの様に自然免疫を抑えようとしているのか調べていたら、比較的最近Science Immunologyにオンライン出版された志賀毒素という懐かしい分子の機能を調べた論文に出会った。タイトルは「Shiga toxin suppresses noncanonical inflammasome responses to cytosolic LPS(細胞質内へ移行したLPSによる非典型的インフラマトゾーム形成を志賀毒素が抑える)」だ。

ウイルスが様々な自然免疫抑制機能を持っていることは、Covid-19が現れる前から理解していたし、このブログでも紹介してきたが、細菌が同じ様な機能を持っていることはあまり考えたことはなかった。

今日紹介する論文は、O-157などの出血性大腸炎の原因菌のトキシンについて研究しているグループの様だ。ご存知の様に、O-157などはファージによる水平遺伝子伝搬を通して、志賀潔博士によって発見された赤痢菌の志賀毒素遺伝子を受け継ぎ、これが激烈な症状の元になっている。志賀毒素(Stx)はグロボトリアオシルセラミドと呼ばれる細胞表面の糖鎖に結合したあと、細胞質内でリボゾームタンパク質の機能を阻害することで、タンパク質合成を阻害することが知られている。メカニズムは違うが、細胞のタンパク合成をまず叩くというのは細菌やウイルスにとっての戦略の様だ。

ただ、これだけだとStxに触れた細胞が死んで出血するという話で終わるのだが、この研究はStxがマクロファージの様な細菌に対する防御機構に対しては、LPSを検出できなくして自らを防御することを明らかにしている。

長くなるので詳細を省いて結論だけをまとめてみよう。

細菌感染に対する重要な自然免疫系はLPSなどの細菌由来エンドトキシンによってスイッチが入る自然免疫系で、この結果NFkb刺激によるTNFやIL-6などのサイトカイン放出、カスパーゼによる細胞死が起こる。

面白いことに、LPSは細胞表面のTLR4に検知されて炎症を起こすだけでなく、細胞質に入って、インフラマゾームと呼ばれる他の炎症経路を介するIL-1βなどのサイトカイン活性化も誘導することが知られているが、Stxはこの経路だけを選択的に抑制する。

そのメカニズムを探ると、インフラマゾームのカスパーゼ11が活性化され、それによりGasdermin Dが分解される経路を阻害することを突き止めている。残念ながら詳細な分子機能は分かっていないが、Gasderminは血液細胞で核酸を分解せずに外に排出するNetosisに関わることを考えると、不思議な炎症の抑え方をしていることがわかる。

研究は現象論だけで、少し物足りないのだが、これほど特異的な炎症の押さえ方をするということは、赤痢菌や大腸菌にとって何か生存に有利な意味があるはずだと思う。

この様にウイルスから細菌までそれぞれが私たちの免疫機能に対応するため進化させてきた抗免疫機能を、ウイルスや細菌の気持ちになって理解できれば、必ず2次的、3次的炎症の特異性を、サイトカインストームという総称ではなく個別に理解できるできる様になるだろう。

しかしこれとは別に、志賀毒素も使い様によっては、炎症制御に使えるかもしれないとも思った。

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1月10日 転写の調節と相分離(1月7日号 Cell 掲載論文)

2021年1月10日

昨年は相分離についての研究が目についた。特にエンハンサーでの転写因子集合から細胞接着、皮膚の果粒層、そして抗ガン剤の効果まで、多くの現象を相分離と関係して説明する研究が多かった。ただ、夏以降は新型コロナ論文に押されて、目にする機会が減った気がしていた。

その意味で今日は久しぶりに転写調節と相分離の論文について紹介する。転写と相分離研究の大御所MITのRichar Youngのグループの研究で1月7日号のCellに掲載されている。タイトルは「RNA-Mediated Feedback Control of Transcriptional Condensates (RNAによる転写凝縮のフィードバック調節)」だ。

この研究が注目したのは、転写時に合成される逆向きの短いノンコーディングRNAの役割だ。これまで、この様なRNAが転写を上げたり下げたりする可能性が示され、クロマチン構造の変化を誘導する可能性などが示唆されていたが本当のところのメカニズムはよく分かっていなかった。この研究では、この短い RNAが濃度依存的にポリメラーゼを含む転写複合体の相分離形成を調節することで、転写調節部位への複合体のロードを促し、その後濃度が上がると相分離が解消し、開始点からの転写複合体が遊離され転写が進むというシナリオの可能性を調べている。

まず、転写開始点とアクチベーターをつないでいるMediator分子に、エンハンサー領域で転写された短いRNAを加えると、濃度依存的にMediatorが相分離を起こすことを確認する。さらに、この相分離がRNAの特異的配列によって調節されているのではなく、RNAの化学的性質に単純に依存して起こっていることを確認する。

この二つの結果は、エンハンサーとプロモーターが集まる部分で合成されている短いRNAがmediatorの相分離を促すことで、ポリメラーゼを含む転写コンプレックスが集められることを示している。

ただ、このままだと転写マシナリーはそのまま相分離された凝縮体の中に捕捉されたままになる。この問題に対し、Youngらはこのとき徐々に短いRNAの量が上昇してくると今度は相分離構造が解消され、これにより転写マシナリーが解放され、転写が進むと考えている。これを証明するために、Medicatorが相分離するとき短いRNAの量を増やすと、相分離が起こらないことを確認している。

あとは、試験管内の転写系を用いて、この様な現象が見られるか確認する実験を行い、試験管内で観察される相分離体の形成が転写効率に関わり、そこに外部から短いRNAを加えると相分離が壊れ転写効率が低下することを示している。

最後に同じシナリオが細胞内でも起こっているかを確かめるため、蛍光標識したmediatorを発現させた細胞で転写開始点での相分離をモニターできる様にし、そこに短いRNAの合成を止めるアクチノマイシンやDRBを加えると、相分離体が安定化してしまうことを示している。

最後に、レポーター分子(ルシフェラーゼ遺伝子)の開始点で短いRNAの合成量を変化させられるコンストラクトを導入した細胞で、実際にRNAが低いところで相分離体が形成され、高くなると相分離体が解消されることを示している。さらにこのとき発現させるRNAの長さを変えて相分離との関わりを調べることで、最初短いRNAが合成されるとMediatorの相分離が促され、時間が経ってRNAの濃度が上昇し、また長いRNA が転写されると相分離体が解消されやすいことを示している。

以上が結果で、いつもながら自分が学んできた転写調節に、新しい視点を与えてくれるさすがと思わせる論文だった。と言っても、この分野のプロから見たら、まだまだ概念先行に見えるのではと思う。しかし、細胞の中でどれほどの数の相分離が進んでいるのか、ちょっと心配になってきた。

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1月9日 RNAワクチン開発のBiontechが考える、ワクチンで免疫を抑えるという新発想(1月8日 Science 掲載論文)

2021年1月9日

我が国で最初に接種が始まる新型コロナウイルスに対するワクチンはファイザー/ビオンテックのRNAワクチンになることは専門家でなくても知らない人はいない。しかしほとんどの人が、このワクチンの中核の技術が、ドイツ・マインツ大学発のバイオベンチャー・ビオンテックにより開発されたことを知らないのは残念だ。

今回Covid-19ワクチン開発のトップに躍り出たドイツのビオンテックも、米国のモデルナもほとんど無名のベンチャー企業だが、RNAを用いた地道な研究を続けており、個人的にはガン免疫を誘導する治験に大きな期待を寄せていた。

今日紹介するマインツ大学とビオンテックからの論文は、なんと同じ技術を用いて自己免疫病を抑えるワクチンを作れる可能性を示す研究で1月8日発行のScienceに掲載された。タイトルは「A noninflammatory mRNA vaccine for treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis(実験的自己免疫性脳脊髄炎の治療用の炎症を誘導しないmRNAワクチン)」だ。

説明すると長くなるのだが、ビオンテックもモデルナもリポソームに包んでデリバーするmRNAには天然のリボ核酸ではなく、メチル化されたウリジンを取り込ませたmodified mRNAを使っている。これはRNAを細胞内に導入する操作では広く使われている手法で、ワクチンの場合、mRNAの寿命が長くなり多くのタンパク質が合成できることと、細胞内での自然免疫の刺激が少なく、副反応を抑えることが可能だという点が大きい。

この特徴は、自然免疫を刺激して獲得免疫を誘導するという点ではネガティブだが、今回の新型コロナウイルスに対する治験結果を見ていると、ちょうど良い塩梅にこのバランスがとれたと結論できるのかもしれない。いずれにせよ、天然のウリジンとメチル化ウリジンを使い分けることで、自然免疫誘導性の高いものから低いものまで、今後目的に応じてワクチンを使い分ける可能性が生まれる。

今日紹介する論文はまさにこの可能性を追求したもので、T細胞に起因する抗原特異的な炎症による自己免疫病、抑制性T細胞を誘導できるワクチンを用いて抑える可能性を調べている。研究では、実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘導するアミノ酸が11個並んだポリペプチドをコードするmRNAを天然のRNA(wRNA)とmodified RNA(mdRNA)を用いて別々に作り、これをリポソームで包んで静脈注射し、脾臓での炎症性サイトカインを調べると、wRNAでは炎症性のサイトカインが強く誘導されているが、mdRNAではほとんど誘導がなく、炎症誘導性で両者は全く異なることを示している。

同じ様な実験はモデルナもすでに発表しているが、このときはワクチンが炎症を強く起こさないことを示す目的で使っている。一方今回のビオンテックの研究では、このとき誘導されるT細胞についても詳しく分析し、mdRNAを用いた場合は強く抑制性T細胞(Treg)が誘導されることを示している。

すなわち、ペプチドの様な短い抗原を用いるとき、炎症誘導性の低いmdRNAはエフェクターの代わりにTregを強く誘導することがわかった。

こうして誘導したTregが自己免疫反応を抑制できるか調べる目的で、同じ抗原を前もって注射して誘導する自己免疫性脳脊髄炎で、症状の出る前にmdRNAによるワクチンを注射すると、発症を抑えることができる。また、発病後にワクチンを注射しても病気の進行を抑えることができる。

さらに、同じミエリン抗原で違う部位のペプチドのmdRNAを用いたワクチンを調整して投与しても、ミエリンに対する自己反応による病気であれば抑えることができる。すなわち、同じ場所で刺激され、IL10などの炎症を抑えるサイトカインを分泌して免疫反応を抑えることがわかった。

このことは、自己免疫に関わるペプチドが同定できなくても、免疫反応を誘導している抗原が特定さえできれば、その一部のペプチド抗原のmdRNAを使うワクチンで治療する可能性を示している。

最後にscRNAseqを用いて、このワクチンを投与された自己免疫性脳脊髄炎マウスでは、抗原特異的T細胞が消失するのではなく、予想通りTregが誘導され、エフェクターT細胞を抑えていること、そしてこの効果はチェックポイントを阻害すると消失することを示している。

結果は以上だが、この論文を読んで私はRNAワクチンの大きな可能性を実感した。もともと、配列がわかればすぐワクチンが作れるという機動性を生かして、ガンワクチンの主流になると予想していた。しかし、今回の新型コロナウイルス感染に対する超迅速なワクチン開発から分かった様に、新しいパンデミックに対する切り札としての役割も実感した。そのうえこの論文から分かる様に、細胞内での自然炎症の強さを調節して、免疫を上げたり下げたりできるワクチン開発まで視野に入ると、可能性は一気に広がる。

マインツ大学の実際の名前はヨハネス・グーテンベルグ大学だが、グーテンベルグによる活版印刷は、ヨーロッパ文化の大改革とともに、文化の大衆化に大きな役割を果たした。その意味で、RNAワクチン手法が、安価な遺伝子操作法、免疫操作法として普及することを期待したい。

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