私たちのNPOはなぜかパーキンソン病の患者さんたちとの交流が多いが、付き合ってみると、再生医療でドーパミン神経を再構成させるという根本的治療だけでなく、もっと生理学や薬理学に基づいた、対症療法も大事なことがつくづくわかる。そしてそのためには、パーキンソン病でおこる神経細胞の変化を深く理解する必要がある。

一般的医学として習うパーキンソン病の生理学は、かなり大雑把なもので、「視床・皮質運動回路は、脳の様々な情報が集まる大脳基底核の調整を受けており、この調節はドーパミンが抑制性に、アセチルコリンが興奮性に働いてバランスを取っている。パーキンソン病ではこの抑制が外れるため、基底核が興奮して筋肉が緊張し、震えがくるため運動が障害される」と習う。この知識をやりくりして、患者さんと話したりしているが、患者さんの症状をこれだけで明確に説明できることはまずない。

今日紹介するスタンフォード大学からの論文は、マウスの基底核の有棘神経細胞集団の興奮を長期間観察し続けてパーキンソン病の生理学の基礎を確立しようとした論文でNatureオンライン版に掲載された。タイトルは「Diametric neural ensemble dynamics in parkinsonian and dyskinetic state(パーキンソンとディスキネシア状態での相反する神経集団の統一的動態)」だ。

運動の視床皮質回路を抑制的に調節している基底核は、２種類の有棘神経細胞によりバランスが取られている。一つは淡蒼球内節を介して直接視床に影響するdirect pathwayの神経細胞で、もう一つが淡蒼球外節・視床下核を介するindirect pathwayで、この２種類は互いに拮抗していると考えられている。この研究では基底核のdirectおよびindirect有棘細胞集団(dSPNとiSPN)を生きて活動しているマウスで、それぞれを区別して連続的に観察し、運動時、ドーパミンが欠乏したパーキンソン状態、ドーパミンが高まったディスキネジア状態など様々な条件で調べている。基本的には、神経を記録しただけに見える論文だが、多くの細胞を同時にモニターすることがどれほど大変かがひしひしと伝わる研究だ。しかし、この領域でのスタンフォード大学の貢献は群を抜いている印象がある。

詳細を省いて結果をまとめると、
１） dSPNとiSPNはほぼ同じようなタイミングで活動しており、決して反応にずれはない。
２） ただ、運動が始まる前には、興奮するdSPN,iSPNが一つの領域に集中する。すなわち、抑制と興奮がまとまるように調節を受ける。この結果運動回路の抑制と興奮のバランスが取れる。
３） ドーパミンが慢性的に欠乏しつづけると、iSPNは運動時に興奮が正常化する。しかし、dSPNはそのまま変わらない。従って、急性期とは異なる運動バランス状態が成立する。
４） 急性のパーキンソンモデルでドーパミンの量が減ると、dSPNの興奮が低下し、iSPNの興奮が高まる。この結果、抑制が優位になり、不随意運動が高まる。
５） 一方、ドーパミンを投与されディスキネジアが起こるときは、dSPNが過剰に興奮する一方で、iSPNの活動が全般的に抑えられる。
６） パーキンソン、ディスキネジアのどちらの場合も、dSPNとiSPNの協調的な興奮は全く見られなくなる。
７） SPNの動態でパーキンソン病をモニターしたとき、治療効果が最も高いのはL-Dopaで、２種類あるドーパミン受容体の刺激剤はともにdSPNの活動を抑える。
などだ。

基本的にはこれまで言われていたように、dSPNとiSPNが拮抗的に働くという図式は同じだが、運動前に両方が限られた領域で協調するという現象を見出し、これがパーキンソン、ディスキネシアの両方の状態で分離してしまうことがこの研究のハイライトだろう。これにより、様々な症状をある程度説明できるようになる気がする。いずれにせよ、単純な興奮だけでなく、興奮のクラスタリングをモニターする方法は確立した。是非、ディスキネジア状態から改善するための薬理学に役立ててほしいと思う。

最近の人間の脳についての研究を見ていて驚くことの一つは、磁場や電流を脳の様々な領域に照射して、脳や病気をコントロールする方法の急速な進展だ。侵襲性が少ないことから正常のボランティアにも脳操作が行われ、記憶を促進したり、自分の性格を乗り越えたりする効果があることはこのブログでも紹介した。この方法はシナプスの結合を強める効果があると考えられているが、メカニズムを完全に理解できているわけではない。それなのに、記憶が高まるならと、一般用の機械まで販売される事態にまで至っている。ただ、論文を読んでいると、物理的刺激にも関わらず効果が長く続く。もしシナプスの結合に変化があるとするなら、複雑な脳内で何が起こっているのか完全に予測することは難しく、私は正常な人に使うのは当分控えたほうがいいと思う。

一方、これもメカニズムは完全に理解できたわけではないが、病気の治療への応用は目覚ましいものがある。中でも、お薬で治療が難しいうつ病の治療に対する経頭蓋磁場刺激（TMS）による治療法は、臨床治験を経てFDAにも承認され、わが国でも保健は適用されていないものの昨年薬事承認された。ただ、FDA に認可されている方法は（１０Hzの磁場を6000回近く照射する）一回の治療に約４５分はかかるため、治療できる人数が限られており、わが国だけでも100万人以上と推定されているうつ病の治療とし普及するにはもっと短いプロトコルの開発が必要だった。

今日紹介するカナダ・トロントにあるCenter for Addiction and Mental Healthからの論文は、FDAで認可されている10Hzの磁場を３８分かけて照射する方法と、その後効果が確認されたTheta burst stimulation(TBS:50Hzの磁場を0.2秒間隔で３分間照射する)方法を比べた無作為化臨床治験研究で４月２８日号のThe Lancetに掲載された。タイトルは「Effectiveness of theta burst versus high frequency repetitive transcranial magnetic stimulation in patient with depression: a randomized non-inferiority trial（うつ病患者さんに対するtheta burst法と高頻度反復性経頭蓋磁気刺激法の比較：無作為化非劣勢試験）」だ。

今回対象に用いた患者さんはハミルトン尺度と呼ばれる自己申告に基づく基準値が１８以上で、一般の抗うつ剤の効果が見られなかった患者さん414名を無作為化して、FDAが認可したTMS法と、新しいTBSに振り分け週５日照射を４週間続けている。

TMSをうつ病治療に用いた治験論文を読むのは初めてだが、確かに驚くべき効果だ。TMSもTBSもともに、ほぼ半数に効果がみられ、３割が寛解している。ハミルトン指標も平均値で最初の２４程度から、1４程度に低下し、少なくとも効果は１週間続いている。これまで抗うつ病治療を続けていた患者さんであることを考えると、素晴らしい結果というほかない。ただこの研究の目的は、磁場治療自体の効果ではなく、従来のTMSとTBSを比較することで、この点については効果に差がないという結果だ。しかし、TBSが３分の照射で済むことを考えると、一台の機械で治療を受けられる人数は１０倍近くに増やすことができる。こうしてみていくといいことづくめの経頭蓋磁場照射だが、頭痛が６５％の人で起こるなど、副作用も間違いなくある。幸い、４週間の治療期間でドロップアウトするほどではなかったようで、なんとか耐えられるレベルの副作用だ。もちろん、抗うつ剤と比べても、だいたいコントロール可能な程度でおさわっているのだろう。

とはいえ、効果のメカニズムが完全にわからないのはやはり気になる。TBSはともかく、TMSについてはかなり症例数も増えてきているはずだ。今後できるだけ早く、自殺率や再発の有無など長期的な経過とともに、MRIによる構造学的変化の追跡など、反応した人のゲノム解析などより踏み込んだ解析結果が発表されることを願っている。うつ病領域でもう一つのトピックスは、麻酔薬ケタミンが注射後２４時間でうつ病症状を改善させるという結果だ。これについては、動物実験で少しづつメカニズムがわかってきている。ぜひ、この治療との比較研究も行い、最も安全で確実な治療法を開発してほしい。

最近、体内で分泌されて炎症を誘導するTNF, IL-6, IL-17など様々なサイトカインに対する抗体療法が開発され、炎症治療は大きく変化した。しかし、それ以前はステロイドホルモンか、抗炎症剤と呼ばれる化合物が治療の中心だった。このうちの最も歴史が古い薬剤がアスピリンだが、この化合物は、体内で合成され炎症を誘導する物質で最も有名な分子はプロスタグランディンで合成を抑制することがわかっている。

アスピリンから抗体治療まで全て体内で分泌される炎症誘導物質の機能をおさえるのが炎症治療の中心だが、体内では炎症を抑える物質も合成されており、それを抗炎症剤として使えることを2016年ワシントン大学のグループが発表した。これがイタコン酸だ。この研究によると、イタコン酸はLPSなどによる刺激を受けたマクロファージで特に産生が高まり、TCAサイクルのコハク酸でハイドロゲナーゼを抑えることでコハク酸の合成を高めて炎症を抑えることが示された（Cell Metabolism 24:158, 2016）。すなわち、体内に備わった炎症のフィードバック機構になっている。

今日紹介する論文は2016年の研究の続きで、イタコン酸の作用はコハク酸の上昇だけでは説明しきれず、実際にはこれとは異なる新しい経路で抗炎症作用が発揮されていることを示した研究で ４月２５日号のNatureに掲載された。タイトルは「Electrophilic properties of itaconate and derivatives regulate IκBζ-ATF3 inflammatory axis（イタコン酸とその発生物質の求電子的性質がIκBζ-ATF3を介する炎症経路を調節する）」だ。

この研究では、コハク酸による炎症抑制以外の経路を探索するため、イタコン酸を処理したマクロファージで誘導される分子を調べ、イタコン酸処理により求電性の物質や外来の化学物質により細胞がストレスにさらされた時の反応と同じ経路が活性化されていることに気づく。そして、このイタコン酸により誘導されるストレス反応の原因が、ストレス物質を中和するグルタチオン（GSH）にイタコン酸が結合して、GSHがストレス物質を中和するのを抑制するため、ストレスが上がってしまうことを明らかにしている。そして、求電性のストレス分子が蓄積すると、不思議なことにLPSによる刺激のメディエーターIκBζの翻訳が特異的に抑制され、炎症が抑制されることを示している。

あとは、なぜ求電性物質によるストレスが、炎症を抑えられるのか検討し、
１） イタコン酸処理によりストレスが上昇すると、マクロファージ内でATF3が誘導される。
２） ATF3の作用によりeIFαがリン酸化されると、IκBζの翻訳がなぜか特異的に低下する。その結果、LPSによる炎症反応は抑制される。
３） LPSなど自然免疫による炎症時にイタコン酸が合成されるのは、体内に備わった炎症を抑える自然のフィードバック機構になっている。
４） 同様の効果は、イタコン酸でケラチノサイトを刺激しても見られる。
５） イタコン酸はLPSだけでなく、IL-17のようにIκBζを活性化することで起こる炎症を抑える。
以上、なぜ翻訳が特異的に抑えられるのかなど明らかにならない部分も残っているが、イタコン酸を体が備わった抗炎症剤として働くメカニズムを理解した上で、TLR7/8 刺激によるマウスの乾癬モデルを細胞内に浸透できるイタコン酸の派生分子で治療できるか調べて、期待通り炎症をほぼ完全に抑えることを明らかにしている。

もともとイタコン酸は細胞内で産生されており、食品安全委員会などから安全と認可された分子だ。したがって、この論文の結果はすぐに実際の臨床現場で調べ直すことができる。おそらく当面は、動物モデルで有効性を示すことができた乾癬の治療に使われるのではと期待される。難治性の乾癬もサイトカインの抗体などで抑制できるようになってきたが、もし細胞の中にある単純な代謝物にこれほどの効果があるなら、新しいメカニズムの治療として期待できる。本当の意味で

自然治癒の仕組みをうまく利用した、安全な治療法の開発が成功するか期待を持って見ていきたい。

我が国ではクリスパー＝遺伝子編集として報道されることが多い。しかしクリスパーとは外来の核酸の侵入に対する特異的免疫機能に他ならず、特異的にDNAやRNAの配列を記憶し検出する機能が系の共通の条件で、あとの機能は自由自在に組み合わせられるという本質が忘れられてしまう。しかしこの根本を理解した上でこの系の機能的多様性を巧みに利用して遺伝子編集以外の様々な用途にこのシステムを使おうとする研究者が数多く存在している。例えば、生きた細胞の核の中で、ある特定の遺伝子がどこに位置しているのか連続的にモニターすることができるのは、CASがクリスパーRNA(crRNA)が結合するゲノム領域に結合できるからで、CASの本来の機能を除去し蛍光タンパク質を結合させれば特定の遺伝子の核内の位置を知ることができるというわけだ。このように、crRNAと標的の特異的結合だけに結合するCas分子の基本の上に、核酸に対する働きかけはCasごとに異なっていることから、その活性をうまく利用することで、「びっくりおもちゃ箱」のように新しいアイデアを刺激し、思いもかけない可能性が示されてきた。

今日紹介するこの分野の開拓者Doudnaさんの論文は通常用いられるCas9とは酵素活性が異なるCas12を研究する中で、これをウイルスなどの特異的遺伝子の高速・高感度検出に使えることを示した研究で4月27日号のScienceに掲載された。タイトルは「CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single stranded DNase activity(CRISPR-Cas12aの標的への結合は非特異的一本鎖DNA分解酵素活性を解き放つ)」だ。

crRNAとDNAが結合した時、多くのCasでは、それを認識して例えばDNAを切断するなど、一つの機能を発揮する。これに対し、同じようにDNAをカットしたあと、これにより変化したcrRNAの構造をスイッチとして使って、全く新しい機能を発揮する２重機能をもつCasの存在が、の2016年,やはりこの分野の開拓者Charpentierさんたちのグループが発見していた。

今日紹介するDoudnaさんたちの研究では、Lachnospiraceaeという細菌種から新しいCas12aと呼ぶ新しいCasを精製し、その酵素活性を試験管内で調べるうちに、この分子がcrRNAが結合した標的DNAを切断するだけでなく、同じ反応系に存在する全ての一本鎖DNAを完全に分解してしまうことに気づく。しかも、この一本鎖DNAは標的と全く関係なくても分解されることがわかった。

生化学実験から、このCas12aがcrRNAとDNAの結合を認識して標的にカットを入れてcrRNAが変化するとカットされた基質がスイッチになって、全ての一本鎖DNAを分解する酵素活性が新たに誘導されることがわかった。２重鎖DNAが標的の場合、この活性化にはPAM配列と正確なcrRNAと標的の一致が必要だが、一本鎖DNAを標的にする場合は、DNAとcrRNAが結合しておれば十分なことが明らかになった。即ち、新しい酵素活性の誘導自体は、crRNAと標的一本鎖DNAが結合して居れば良いが、2重鎖DNAが標的の場合はcrRNAがCas12aを活性化できるよう変化する必要があり、そのためには配列特異性とPAMを介した特異的標的DNAのカットが必要になる。極めて精巧な酵素だとつくづく感心する。
そして最後に、このcrRNAと標的DNAで活性化できる一本鎖DNAを分解する活性は他のバクテリアのCas12aにも存在することを確認している。

以上から、Cas12aが持つ無関係の一本鎖DNAを分解してしまう活性を、crRNAと標的DNAの特異的結合により制御できることがわかる。そこで、この特性を利用するとウイルスなど外来のDNAの高感度の検出法が開発できると着想して、ヘルペスウイルスを例に、これが実現可能であることを示している。

詳細は述べないが、方法は以下のようなものだ。先ず生化学的検討から明らかになった、ウイルスに対する至適なガイドRNAを合成する。次に、ウイルスDNAを増幅して、そこにガイドRNA とCas12aを加える。ガイドに一致するウイルス配列があると、特異的にCas12aの一本鎖DNAに対する分解酵素活性のスイッチが入る。ここに、切断されると蛍光を発するようにした一本鎖DNAを加えておくと、反応液が蛍光を発するという段取りだ。これを用いて、微量なヘルペスウイルスを極めて高い特異性で検出できることを示して論文を締めている。

Doudnaさんの論文と同時に、もう2編、同じ趣旨の論文が同じScience に掲載されており、この分野でいまも熾烈な競争が繰り広げられているのがわかる。ただ、検査法の開発だけでなく、Cas12aの生化学がわかりやすく示されているのは、さすが本家のDoudnaさんと言っていいだろう。

しかし、crRNA と標的核酸の結合を検出する共通性の上に、これほど多様な機能を生み出している進化にはただただ驚くだけだ。