自分で実験をして論文を最後に書いたのは、京大医学部分子遺伝に移って２−３年ぐらいだったと思うが、後始末の悪い教授がクリーンベンチやセルソーターの前で怒鳴っているのを見るのは、教室の人たちには苦痛だったと反省している。その時の実験の目的は、胎児血管内皮をソーティングして、血管内皮から血液が間違いなく出てくることを証明することで、Immunityに掲載された。そのあとは引退するまでまともな実験はしなかった。

今日紹介するハーバード大学からの論文は、読んでいて自分でおこなった最後の実験のことを思い出す仕事で、リンパ管分化に必須分子、Prox1 の転写を調節するエンハンサーの活性を調べる過程で、Prox1分子の発現が低下すると、リンパ管内皮細胞から血液が発生できるようになる事を示した研究で、１月１８日 Nature にオンライン掲載された。タイトルは「A Prox1 enhancer represses haematopoiesis in the lymphatic vasculature（Prox1エンハンサーはリンパ管で血液発生を抑制している）」だ。

このグループは以前 GATA2 変異により Emberger 症候群と呼ばれる遺伝的リンパ浮腫が起こることを発見しており、今回の研究はその延長にある。GATA 結合部位とともに、リンパ管発生に必須の様々な転写因子が結合する Prox1 発現調節エンハンサーを染色体免疫沈降により特定したあと、この領域 800bをレポーター遺伝子と結合させ、トランスジェニックマウスを作り、エンハンサー活性を調べている。結果は明瞭で、発生期から成長後も常にリンパ管内皮に発現が見られる。成長後は特に大きなリンパ管の内皮やリンパ管の弁に発現が限局されてはくるが、この領域が Prox1 によるリンパ管発生調節に最も重要な領域であることを確認する。

この結論をさらに確認するため、エンハンサー領域を含む11kbをゲノムからノックアウトすると、生き残るマウスもいるが、半分以上が発生過程でリンパ管発生異常をきたして死亡する。リンパ管内皮細胞は分化していても、組織化されたリンパ管が形成できない。これは、GATA2 だけでなく、この領域にある様々な転写因子の結合ができなくなるため、リンパ管発生に必要な Flt4 などが発現できないためで、Prox1 が機能するためにはこの領域が様々な調節因子のハブになっている事がわかる。

そしてこのリンパ管異常を示すマウスの頸部リンパ管内腔に、なんと Runx1 陽性、c-Kit 陽性の血液細胞様のクラスターを発見する。そこで、このマウスからリンパ管内皮をソートして培養すると、CD45陽性の血液細胞が発生することを確認している。

以上の結果は、リンパ管のアイデンティティーを保つためには、Prox1 の発現調節が必須で、リンパ管発生に関わる分子の発現だけでなく、血液や血管内皮への分化を抑制する役割をしていることが示された。逆に、血液、血管内皮、リンパ管内皮が、それぞれ簡単にプログラム変更が起こる可能性を持っていることも明らかになった。この研究で特定された領域に、多型が存在しているかどうか確かめてみたくなった。

パーキンソン病（PD）の多くが αシヌクレインタンパク質の折りたたみ異常によって引き起こされることがわかってきて、レビー小体型認知症、多系統萎縮などと合わせてシヌクレイン症として扱うようになってきた。最近、αシヌクレインをリン酸化し、折りたたみ異常を誘導する分子として、慢性骨髄性白血病のドライバーとしても知られる c-Abl が関わっている事がわかってきた。このことは極めて重要で、c-Abl阻害剤が PD治療に使える可能性を示唆している。この考えで、白血病に用いられている nilotinib をパーキンソン病の治療薬として使う治験が行われたが、脳内移行が限られているため、うまくいっていない。

今日紹介するジョンホプキンス大学からの論文は、脳内移行が可能な c-Abl阻害剤を開発し、その効果を確かめたマウスを用いた前臨床研究で、１月１８日号Science Translational Medicineに掲載された。タイトルは「The c-Abl inhibitor IkT-148009 suppresses neurodegeneration in mouse models of heritable and sporadic Parkinson’s disease（c-Abl阻害剤 iKT-148009 は遺伝的および孤発性パーキンソン病マウスモデルを抑制できる）」だ。

これまでの研究から c-Abl が PD の治療表的になる可能性はわかっていたので、この研究では独自の化合物デザイン方法を用いて設計、合成した化合物の中から、経口投与可能で、脳内移行できる c-Abl特異的化合物として IkT-148009 を突き止める。これが研究のハイライトで、あとはこの化合物の効果を様々な PDモデルで確かめている。

まず、シヌクレインとは関係がない、細胞毒注射による黒質細胞障害モデルで IkT-148009 を投与すると、細胞死を抑制する。これは、c-Abl によりドーパミン神経細胞死に関わる Parkin や Paris、AIM2 などの活性化が起こるからで、c-Abl阻害が一般的神経細胞し保護効果を持つことを示している。

次に、異常αシヌクレインを発現させたトランスジェニックマウスモデルに IkT-148009 投与実験を行い、機能的、病理的にも PD の進行が抑えられること、また αシヌクレインのリン酸化が期待通り抑制できていることを確認している。

最後に、脳内に異常αシヌクレインを注入して、孤発性PD を誘導するモデルに IkT-148009 を投与する実験を行い、PD 発症を強く抑制するだけでなく、シヌクレイン沈着、伝搬を抑えられることを示している。

以上が結果で、脳内移行、阻害活性など、まだまだ改善できるのではと思うが、c-Abl阻害剤が、αシヌクレインのリン酸化、沈殿、伝搬を抑制するだけでなく、ドーパミン神経の細胞死一般も抑制できる、一種夢の治療薬になる可能性を示唆している。

もう一つ知りたいのは、どのステージで治療を始めれば PD 進行を止められるのかだ。おそらく、ドーパミン神経が残っておれば、治療効果を期待できると思うが、今後詳しく調べる必要があるだろう。大きな進展を期待したい。

歳をとると涙脆くなるという人もいるし、逆に鈍感になるという人もいる。ただ、うつ状態が広がっているという話を聞くと、ここでも紹介してきた何もしない時に活動し、自分自身に向いた思考を支えるdefault mode networkが老化と共に変化する可能性は高い。

今日紹介するジュネーブ大学からの論文は、人が辛い思いをしているビデオ、あるいは毎日の普通の生活のビデオを見た時の感情と、そしてそれをみた後の脳の活動を機能的MRIで調べ、若者と高齢者を比較した研究で、１月１２日 Nature Aging にオンライン掲載された。タイトルは「Exposure to negative socio-emotional events induces sustained alteration of resting-state brain networks in older adults（ネガティブな感情的出来事は高齢者特異的に見終わった後も安静状態の変化を誘導する）」だ。

まず、自己申告形式で高齢による様々な変化を調べてみると、感情の起伏が少しではあるが低下しているが、多様な見方ができなくなっているという結果だ。

次に、やはり自己申告形式で、ビデオに対する気持ちを聞くと、一見、若者と比べた時の変化は素人には大きくないように見える。ただ、いろいろ調べると、ビデオに対する共感とネガティブな気持ちがほとんど連関しない。言い換えると、ネガティブな感情に鈍感といえる。

この変化の脳科学的背景を調べるため、社会性認知に関わる後帯状皮質および前頭前皮質、そして感情に関わる扁桃体や島皮質の活動を調べると、年齢を問わず、深い共感とネガティブな感情に襲われた時、感情に関わる扁桃/島皮質と、後帯状皮質/前頭前野の活動が連動するようになる。ただ、感情領域自体の活動はビデオでは特に変化するわけではない。

同じビデオに、高齢者も心を動かされるというわけだが、ではなぜ高齢者でネガティブ感情が強くならないのか。

一つは、高齢者は強い共感を呼ぶビデオに対して、感情に関わる領域の反応は若者と比べて低く、逆に社会性に関わる領域の活動は高い。

さらに重要なのは、このネットワークの結合反応がビデオを見終わった後も高齢者で長く続くことで、これにより感情の時間的起伏が抑えられることになる。まさに、emotional inertia として知られる、感情変化への抵抗性が高齢者に存在することがわかる。この結果は、ネガティブ感情を強く抱かないという自己申告結果と一致している。

以上が結果で、自分に当てはめると当たることも当たらないこともあるが、このような脳科学的知見をベースに、もう一度それぞれの感情状態を調べることは重要だと思う。

老人はキレやすいのか、キレにくいのか？この研究ではキレにくいということになるのだろう。

現役時代は骨髄造血についても研究していたが、骨や骨髄にリンパ管が存在するかどうか考えたこともなかったが、その一因はそもそもリンパ管の様子を組織学的に調べるのが難しいためだ。その結果、脳内のリンパ管の存在が広く認められるようになったのはついこの前のことだ。

今日紹介するオックスフォード大学からの論文は、骨のホールマウント染色を工夫して骨髄を含む骨全体のリンパ管を観察できるようにし、放射線照射後の骨リンパ管のダイナミックスやその役割について調べた研究で、１月１９日号 Cell に掲載された。タイトルは「Lymphatic vessels in bone support regeneration after injury（骨のリンパ管が傷害後の再生を支持している）」だ。

なんと言ってもこの研究のハイライトは、マウスの骨を脱灰も含む様々な処理をして見えるように出来たことだ。その結果、骨の中でもリンパ管が血管の中に見事に染め上げられており、骨端に近づくにつれリンパ管の密度が上昇していることがよくわかる。

あとは、リンパ管のダイナミックスを見るため、放射線照射＋骨髄細胞移植後の再生に焦点を絞り、リンパ管の変化を観察している。驚くことに、放射線照射により骨全体でリンパ管の密度は１５日をピークに急速に上昇し、骨や骨髄の再生に何らかの役割を持つように見える。

そこで、リンパ管の増殖に必須の VEGFR3 に対する阻害剤、あるいはリンパ管特異的にジフテリアトキシンを発現させてリンパ管を除く方法を用いて、リンパ管の増殖を止めたときに、造血や骨再生が受ける影響について調べている。

結果は明瞭で、血液幹細胞の骨髄での維持や、骨の再生が強く阻害される。すなわち、放射線照射後の骨リンパ管の増殖が、骨髄造血や骨の再生に密接に関わることを示している。

このメカニズムを探ると、阪大の長沢さん達により示された骨髄造血細胞ニッチ分子、CXCL12 をリンパ管が分泌し、この分泌を遺伝的にノックアウトすると、造血幹細胞の骨髄での維持が著しく阻害される。

骨の再生で見ると、血管外皮由来の、いわゆる多能性を持つ間質幹細胞も CXCL12 の働きにより増加し、骨芽細胞に分化して骨の再生を促進する。事実、この細胞を特異的に除去する遺伝操作により、放射線障害時の骨の再生が低下する。さらに、同じ細胞は骨髄の造血細胞ニッチにも分化し、血液細胞の造血支持にも関わることを示している。最後に、老化とともにリンパ管内皮細胞の修復力が低下することも示している。

以上が結果で、これまで全く忘れ去られていたリンパ管を骨や骨髄再生に位置づけることで、全く新しいシナリオが生まれることを示している。特に造血を支えるニッチについては、骨に接する間質細胞、血管内皮など様々な可能性が追求されているが、リンパ管内皮が CSCL12 を発現することは、これまでのデータも新しい目で再検討する必要を示唆している。

以前、熊本大学の三浦さんから、ハダカデバネズミだけでなく多くの長生きでガンになりにくい哺乳動物で、ネクロプトーシスを調節する RIPK と MLKL がともに欠損していることを聞いて、驚いたことがある。現象としてはネクロプトーシスを抑えるとガン発生が抑えられることになる。直感的に考えると、ガンのネクロプトーシスが上昇する方がガンになりにくいと思うのだが、三浦さん達は発ガン実験を通して、ネクロプトーシスメカニズムが炎症を抑えることが、この現象の一因であると考えている。

ただ、炎症とガンの関係は極めて複雑で、一つの図式に押し込むことが難しい。今日紹介するハーバード大学からの論文は TBK1 と呼ばれる自然炎症や代謝調節のハブに存在する TBK1 分子が、ネクロプトーシスにも関わっていて、ガンの免疫治療を高めることを示した面白い研究で、１月１９日 Nature にオンライン掲載された。

この研究はメラノーマのチェックポイント治療抵抗性を調べているとき、メラノーマから TAB1 を欠損させるのが最も効果的であることを発見する。TAB1 はもともと STING 分子を介して自然炎症を高めることが知られていたので、TAB1 欠損でガン免疫が高まることは不思議に思える。

そこで、リンパ球も含むガンオルガノイド培養系を構築し、TBK1 欠損はガン自体の増殖に影響はないが、チェックポイント治療に用いる PD1 抗体と組みあわせると強い腫瘍抑制効果を示すことを明らかにする。

動物実験系で、TBK1 阻害剤がチェックポイント治療を高めることを確認した後、single cell RNA 解析を用いて腫瘍組織の細胞の種類を調べると、特に CD8T 細胞が抗原刺激で疲弊しないこと、および白血球の数が高まっていることを発見する。

これで一件落着に見えるが、阻害剤を用いた実験は、様々な細胞の TBK1 機能を抑制する。事実、最近 STING 分子を T 細胞からノックアウトすると、記憶細胞への分化が促進されることが示されており、この結果も同じ現象を見ている可能性がある。

また、STING 分子、TBK1 分子と続くシグナルは 1 型インターフェロン産生に重要で、TBK1 阻害は炎症を抑えるように思ってしまうが、実際には TNFα や IL2 、そしてγインターフェロンなどの組織でのレベルは高まる。すなわち、TBK1 の阻害は、腫瘍免疫に関する限りトータルで良い効果が得られることはわかるが、腫瘍で TBK1 が抑制されたための効果とは思えない。

そこで、TBK1 欠損の腫瘍自体への影響を探索した結果、TBK1 が TNFα からのシグナル経路で活性化される　ネクロプトーシスを抑える働きをしており、これが欠損するとガン細胞が死にやすくなることを発見している。実際、メラノーマの患者さんで見ると、チェックポイント治療に反応できなかった患者さんではγインターフェロンや TNFα が高いまま経過することがわかった。

以上が結果で、一つのシグナル分子が、ガンとガン免疫の複雑な関係を支えていることを見事に示している。面白いのは、TBK1 阻害によるガン細胞のネクロプトーシス亢進は、三浦さん達がガンになりにくいとして示した RIPK3 や MLKL を阻害すると、完全に消えることだ。すなわち、ガン細胞にとって、ネクロプトーシスの系は、文脈によってポジティブにもネガティブにも働けることがわかる。

これは私の勝手な想像だが、ガンになりにくさとネクロプトーシスの関係は、炎症だけでなく、ガン細胞や老化する細胞自体からも見直してみると面白いように感じた。

老化は様々な原因が合わさって進む過程だが、古くから知られた重要な要因は、DNA 損傷が繰り返されることだ。DNA 損傷は当然突然変異の原因になるので、DNA 損傷に様々な箇所に起こる突然変異による機能不全が、老化の一つの原因と考えられてきた。

今日紹介するハーバード大学からの論文はこの通説を覆し、DNA 損傷もエピジェネティックな再編成を通して老化を進めることを明らかにした重要な論文で、１月１９日 Cell に掲載された。タイトルは「エピジェネティック情報の喪失が老化の原因である」だ。

これまで DNA 損傷誘導には、放射線照射や抗ガン剤、あるいは活性酸素などゲノム全体にランダムに起こる損傷を用いて研究が行われてきた。CRISPR/Cas 系が開発されてからは、部位特異的損傷も可能になったが、系が複雑なためか DNA 損傷手段としてはあまり使われていない。そもそも、DNA 損傷とその修復自体が老化のドライバーなどとは誰も考えていなかったと思う。

この研究は細胞内の DNA 損傷を、制限酵素 I-PpoI を細胞内で発現させることで誘導して、突然変異とは全く無関係の DNA 切断効果を調べることを可能にした。

もう少し詳しく説明すると、I-PpoI は CTCTCTTAA;GGTAGC という極めて長い配列を認識してカットするため、マウスゲノムには２０カ所しか切断可能箇所がない。しかもそのうち１９箇所はノンコーディングで、基本的には切断が突然変異につながらない。また変異が起こったかどうかを２０箇所で調べるのは簡単だ。

この方法を着想したことで、純粋に DNA 切断と修復自体が老化に及ぼす影響を調べることが出来る。実験は、生後２−６ヶ月目に３週間だけ I-PpoI を全身で発現させ、老化の程度を観察している。勿論ゲノム配列を徹底的に調べ、これによる突然変異は起こらないことを示し、切断が起こり、きれいに修復されるという過程が３週間繰り返したことがわかる。

このマウスの観察を続けると、３週間しか処理しなかったのに、あらゆる臓器で老化が促進する。例えば認知機能を調べると、著明な記憶障害が起こるとともに、脳ではアストロサイトやミクログリアが活性化し、いわゆる神経炎症状態になっている。筋肉も同様で、筋肉機能や筋肉量が低下する。

この原因を調べると、３週間という短い期間の処理で、しかも正確に修復が行われているにもかかわらず、H3K27 ヒストンのアセチル化で見たときのエピジェネティックス状態が、クロマチンがオープンなところでは閉じる方向に、閉じたところではオープンになっていることがわかる。さらには、染色体の 3D 構造にも変化が起こり、エンハンサーとプロモーターの位置がずれて相互作用が起こらなくなっていることがわかる。

すなわち、全ゲノムでたった２０カ所しか切れていないのに、それを修復する過程により、ゲノム全体でクロマチン構造が大きく変化し、その結果老化が進むことを明らかにしている。実際、これにより例えば筋肉で免疫系の遺伝子が発現したりする異常な状態が出来ている。

ただ、これはあくまでもエピジェネティックな変化で、山中４因子を導入することで完全にリプログラムできる。

以上が結果で、老化領域では極めて重要な貢献だと思う。切断と修復の箇所が限定されているため、今後修復によりエピジェネティックを支える分子がどう変化していくかの詳しい過程が明らかになるだろう。例えば本当にサーチュイン分子活性化で老化を抑えられるのかなど、重要な問題の理解が進むように思う。期待したい。

この HP で何度も紹介してきたように、レット症候群は X染色体上の MECP2 遺伝子に、生殖細胞の発生過程で突然変異が入った女児に起こる病気で、発達異常や運動障害など様々な神経症状が特徴になる。従って、病気の根本的治療は、遺伝子から突然変異を除いて正常化することだが、X 染色体遺伝子の場合、もう一つの方法がある。

一般に X 染色体は発生過程で片方が遺伝子発現できないようにエピジェネティックな抑制が起こるため、一つの細胞で働くのはどちらか片方の X 染色体になっている。従ってレット症候群の場合、細胞の半分は正常の MECP2 遺伝子が発現し、もう半分で遺伝子欠損が起こった状態になっている。すなわち、レット症候群の異常は、正常細胞の中に MECP2 が欠損した細胞が混じっていることで起こる。そこで浮上するのが、MECP2 変異 X 染色体を発現した細胞で、不活化されている方の X 染色体上の MECP2 遺伝子を活性化して、細胞レベルで MECP2 発現を正常化するという治療法だ。幸い、X 染色体不活化のメカニズムは詳しく解析されており、標的は明瞭だ。

今日紹介するコロンビア大学からの論文は、レット症候群からの iPS 細胞を用いて、不活化された方の遺伝子を CRISPR/Cas を用いた再活性化する方法の開発で１月１８日号 Science Translational Medicine に掲載された。タイトルは「Multiplex epigenome editing of MECP2 to rescue Rett syndrome neurons（レット症候群の神経を正常化するための複合的エピゲノム編集）」だ。

X 染色体不活化の最終結果は、遺伝子発現に必要な領域がメチル化により完全に不活性になることだ。従って MECP2 遺伝子領域の DNA からメチル基を除いて、使えるようにするというアイデアはおそらく多くの研究グループが行っていると思う。この研究でもまず、メチル化を除去する働きのあるTET遺伝子を遺伝子切断活性を除いた Cas9 と結合させ、ガイドとともに細胞へ導入することで、基本的には不活化された方の X 染色体だけで遺伝子発現の活性化が起こることを明らかにしている。

個々で問題になるのは効率と特異性で、他の遺伝子領域を活性化したりすると大変なことになる。幸い、この研究で調べられた限りでは、操作により変化するのはほぼ MECP2 だけで、全くないとは言えないが、非特異的な作用による危険性はほとんど認められないと結論している。

次の問題は効率で、分化した神経細胞をCas-Tetで処理してもメチル化が外れるスピードは遅く、またたかだか２割程度の細胞でMECP2の発現が復活し、神経活動が元に戻るだけだ。

そこで、さらにこの部位が不活化されるときのエピジェネティック過程を精査し、再活性化がうまくいった場合MECP2遺伝子領域でCTCFと呼ばれる分子が結合していることを発見する。そこで、Cas-Tetだけでなく、MECP2領域にガイドできるCpf1(Cas9と同じような物と考えてもらったらいい)にCTCFを結合させた遺伝子ベクターを開発し、Cas-Tetとともに細胞に導入すると6割のX染色体で再活性化が起こることを明らかにしている。

以上が結果で、臨床応用までは長い道のりがあるとは思うが、メチル化された DNA だけでなく、CTCF 結合まで因数分解が出来ることで、この治療法開発のためにやるべきことはかなり整理することができた。しかしまだ４割以上の細胞がそのまま操作できずに残っているので、さらに改良が進むことを期待したい。

最初、細菌叢のメタゲノム解析はリボゾーム領域の配列を用いて行われていたが、細菌系統レベルの解析は難しいため、母親と子供で細菌叢が共有されていることを本当に証明することは出来ず、大体そうだろうと言った結論で終わっていた。しかし、ショットガンやさらにはロングリード配列決定などが行われ、またインフォーマティックスパワーが進歩することで、存在する細菌のゲノムを再構成することが出来るようになってきた。

今日紹介するトレノ大学からの論文は、世界中から細菌叢の全ゲノム解析を集め、独自に開発した情報処理方法を用いて、細菌叢の個人から個人への伝搬について詳しく調べた研究で、１月１８日 Nature にオンライン掲載された。タイトルは「The person-to-person transmission landscape of the gut and oral microbiomes（腸内及び口内細菌叢のヒトからヒトへの伝搬）」だ。

まず驚くのが、親子から双子の兄弟まで、これほど多くの細菌叢全ゲノムデータが、研究者に利用できる形で存在していることだ。さらに、個々のデータセットに関しては論文も出ているだろうが、全体を新しい視点で見直すことで、この論文の様な重要な貢献が出来ることだ。我が国の若者からも、このような論文が多く発表されることを期待している。

系統レベルで細菌を特定することが出来ることから、例えば母親から子供にどの細菌が伝わったのかを特定することが出来る。特に、系統レベルでは区別がつかない、例えば食事などを通して摂取した環境経由の細菌系統を、人から人へ伝わった細菌系統と区別できる。

結果はこれまで示されてきたことと特に変わりはないが、しかし解析パワーのおかげで、読んだインパクトは大きい。主な内容をまとめると、次のようになる。

1. 腸内細菌叢の伝搬は母親から子供への伝搬が最も大きく、後は家族内、同じ村、と共有細菌種はどんどん低下する。これまで種レベルでは明確ではなかったが、全く共通の系統を共有していないという個体が５％近く存在することで、全ゲノムレベルの検討の必要性を痛感する。
2. 生後すぐの母親と子供の共通性が平均５０％という数字を考えると、まず我々の細菌叢は母親から来ると結論できる。また、この高い共通性は１歳前後まで維持されるが、その後急速に低下するが、２０％近くはそのままほぼ死ぬまで維持される。すなわち、外界とのコンタクトが増えると家族内、村落内の社会的コンタクトに応じて細菌叢が変化するが、系統レベルで生まれてからずっと維持される細菌叢も存在している。
3. 母親から子供以外で、家族内全体で共有される細菌系統が大体２０％ほど存在し、また同じ村落内で共有される細菌系統も１０％前後存在する。すなわち、結局細菌叢の多くは、人間同士の関係で形成される。
4. 口内細菌についても調べており、この場合は母親の役割は強くない。例えば夫婦間の共有と比べると、母親と子供の共有系統は少ない。面白いのは、共有細菌種は子供の年齢とともに増えることで、基本的にはスキンシップをベースに形成される。
5. どの細菌が共有されやすいかを調べると、グラム陰性で、好気環境に耐性のある菌系統が伝わりやすい。

以上が結果で、繰り返すが特に目新しさはないが、しかしデータのインパクトは高い。というのも、こうして整理された伝わり方と伝わりやすさは、これからの細菌叢操作を考える上で極めて重要になる。このような研究が進むと、薄っぺらいデータだけで訴える世間の細菌叢議論も、いつか淘汰されるだろうと期待している。

今日の話は少し専門的すぎるかも知れないが、しかし生命にとっては最も根源的な翻訳におけるストップコドンの話だ。生命が地球上に誕生するとき、物理法則しかないところに、物理法則とは異なるコドンとアミノ酸との関係が生まれる過程はおそらく生物学にとっての最も重要な謎で、tRNA がその鍵を握っている。

ちょっと脱線したが、私たちは６４のコード表を習うが、そのうちの UAA、UAG、UGA という３つのコードはストップコドンで、ここには tRNA のかわりに RF1 or RF2 が結合して翻訳が終わる。しかし、このストップコドンとペアできる tRNA が様々な種で存在することがわかっていた。

今日紹介するチェコ共和国科学アカデミー研究所からの論文は、全てのストップコドンに対する tRNA を持った原虫を材料に、ストップコドンがアミノ酸コードとして使われる進化の必要条件について調べた研究で、１月１１日号 Nature にオンライン掲載された。タイトルは「Short tRNA anticodon stem and mutant eRF1 allow stop codon reassignment（短いアンチコドンステムループを持つ tRNA と eRF1 変異がストップコドンをアミノ酸コードへと変換する）」だ。

この研究はチェコの昆虫から発見された原虫のゲノムを調べるうち、この原虫では GC 配列が低下していて、おそらく GC が AT へと変化するイベントが起こった結果、３種類のストップコドンに対して、UGA に対してはトリプトファン、それ以外に対してはグルタミン酸の tRNA が対応してしまったことを明らかにする。

しかし、こんなことが起こると蛋白合成は大きな変化を起こしてしまって、生物は増殖できないのではと調べていくと、この動物では UGA はトリプトファンとともに、ストップコドンとして使われること。そして、確率論的に tRNA が結合してトリプトファンとして読まれたり、あるいはストップしたり、競争が起こること、そして合成の高い蛋白質では特にトリプトファンとして読まれる確率が高いことを明らかにする。

では、なぜこのような使い回しが起こったのか。長い話を短くしてまとめると次のようになる。

まず、ストップコドンに対応した tRNA だけが、アンチコドンの周りにあるステムループと言われる RNA のペアリングの長さが 4bp しかないことを発見する。実際同じことが起こっている他の生物でも同じことが観察されることから、この変異が起こることでアミノ酸にも使い回しが可能になる。

ではなぜこのようなことが起こるのかと考えると、外来の侵入者の RNA も同じコドンルールを使っていることから、これから逃れるメカニズムとして発達したと考えられる。ただ、トリプトファンの tRNA のアンチコドンループが短くなると当然翻訳もおかしくなるはずだが、この時短いループの tRNA をリボゾーム上でうまく利用するために、リボゾーム上での蛋白合成を進める役目のある eEF1 に変異が起こっていることも発見する。

この２種類の変異を酵母に導入すると、原虫と同じことを再現できることから、ループが短くなり、eEF1 の変異が起こることで、翻訳がストップコドンを超えて続く現象が確率論的に起こるようになることを明らかにしている。

結果は以上で、生命の根幹とも言えるコドンと翻訳も、一部の分子が変化するだけで、違う可能性が生まれることを示す面白い結果だ。これからも、一種例外に見えるが生命のルールが厳守される例が多く見つかっていくと期待している。

今日のタイトルを見て、「エッ？マウスのAAVベクター？今更なぜ？」と、思った読者も多かったのではと思う。実際、ヒト遺伝子治療を究極の目的とした効率のいい AAV ベクターが既に開発されており、CRISPR/Cas を用いた遺伝子ノックインが可能になりつつある。

しかし、新しい技術の効果を確かめるためには、どうしても動物実験モデルが必要で、特に免疫反応のような複雑なシステム解析にはマウス実験が重要になる。ところが AAV ベクターを使うとなると、ヒト特異的に効率化されているため、マウスには使い勝手が悪く、特に CRISPR/Cas のような遺伝子導入効率が求められる実験には困難を伴う。

今日紹介するカリフォルニア大学サンフランシスコ校からの論文は、このニーズに応えてマウス T 細胞に高い遺伝子導入効率を可能にするAAVベクターの開発と、それを用いたガンの免疫治療研究で、１月１２日 Cell にオンライン掲載された。タイトルは「An evolved AAV variant enables efficient genetic engineering of murine T cells（AAV変異体の進化形はマウスＴ細胞の高効率の遺伝子操作を可能にする）」だ。

研究の目的の一つは、AAV ベクターの特異性や効率を進化させて目的に合ったベクターを開発できるかだ。このために、マウス T 細胞にはほとんど感染しない,

ヒト用に開発された AAV6 をスタートラインとして、このカプシドの一部をランダムなアミノ酸配列に置き換えたベクターをマウス T 細胞に吸着させ、T 細胞に侵入されやすい配列を特定する進化サイクルを3回繰り返し、最終的にマウス T 細胞に高い遺伝子導入効率を持つ Ark133 ベクターを完成させている。

AAV を進化させられることを示したのがこの研究のハイライトで、新しい Ark133 の感染に関わるホスト側の分子も探索して、これまで知られていた AAV 受容体に加えて、ほかにも４種類の分子が感染効率に関わることをしめし、AAV ベクターはまだまだ開発余地があることを示している。

あとは、正常の T 細胞の T 細胞受容体にガン特異的キメラ受容体を置き換えることに焦点を絞り、例えば CAS9 による遺伝子切断の毒性を修復のための鋳型を Cas9 と同時に導入する方法や、置き換える遺伝子にガイド RNA をつないで切断と相同組み換えを同時に行う遺伝子構成や、さらには相同組み換え以外の修復を抑える操作を加えるなど、様々な改良を加え、最終的に７５％という高効率で遺伝子の置き換えに成功している。

またこうして作成した CAR-T 細胞は、通常のレトロウイルスを用いてキメラ受容体を導入する場合より高い抗ガン活性を示すことも示している。

最後に、同じベクターで２つの遺伝子を同時に置き換える可能性にもチャレンジし、低いとは言え７％という効率で両方の遺伝子を置き換えるのに成功している。

結果は以上で、この方法は CAR-T やその派生技術、特に今後予想される固形ガンに対する遺伝子導入 T 細胞治療の検証に重要であると同時に、マウス T 細胞の操作法として定着するように感じる。