2024年10月7日
タンパク質リン酸化を誘導するキナーゼは、発ガンにも大きく関与していることから、様々な阻害剤が開発され、分子標的薬の主流になっている。こうして開発されたキナーゼ阻害の化合物は、このブログで何度も紹介しているように、例えばタンパク分解システムを引き寄せて、キナーゼそのものを分解してしまうためにも使われる。とはいえ、基本的にはキナーゼの機能を阻害することが目的になる。
今日紹介するスタンフォード大学からの論文は、CDK9キナーゼ阻害剤を使って CDK9 を特定の領域にリクルートしたあと、同じ CDK9 を今度は本来の機能のキナーゼとして使うという、直感的にわかりにくい創薬の可能性を示した研究で、１０月４日 Science に掲載された。タイトルは「Relocalizing transcriptional kinases to activate apoptosis（転写に関わるキナーゼの局在を変化させて細胞死を活性化する）」だ。
この研究が標的にしたキナーゼは CDK9 で、主に cyclinT1 と結合して RNAポリメラーゼのセリン２部位をリン酸化して、転写のスウィッチを入れる。この CDK2 を、転写が BCL6 により抑制されている部位にリクルートして、直接 RNAポリメラーゼを活性化することが、この研究の目的になる。このとき、転写を抑制している分子として選んだのが BCL6 で、B細胞白血病の一つのタイプ、びまん性大細胞型Bリンパ腫の原因遺伝子の一つで、細胞死に関わる様々な遺伝子を抑制することで白血病の増殖を助けている。
もし CDK9 を BCL6 結合部位にリクルートできれば、その場所でだけ RNAポリメラーゼを活性化して転写の抑制を外すことが期待できる。ただ問題は、これに使える CDK9結合化合物は現在のところキナーゼ活性阻害剤なので、BCL6結合部位にリクルートできても、阻害されたままだと利用できない。
この研究では、理屈は後にして、BCL6結合化合物とCDK9阻害化合物を結合させ、BCL6 を発現するリンパ腫を殺せる化合物を探し、CDK-TCIP1 と名付けた化合物を特定している。
生化学的に調べると、この化合物により BCL6結合部位に CDK9 とそれに結合する分子がリクルートされること、その結果その部位に存在する RNAポリメラーゼのセリン2 がリン酸化され、BCL6 によって抑制されていた転写が活性化されることを確認している。
この活性に CDK9 のキナーゼ活性は必須なので、BCL6結合部位にリクルートされてきた CDK9 の一部は阻害剤から離れて、そこで近くの RNAポリメラーゼをリン酸化し、転写を活性化していると考えられる。その結果、アポトーシスに関わる分子が転写され、細胞死が誘導されると考えられる。
最後にこうしてできた化合物の生体内での活性を調べている。まずこの化合物を、薬剤として使える様な修飾を加えた後、マウス腹腔に投与すると、見事にリンパ節の胚中心の形成を抑えることを示している。BCL6 は胚中心形成に必須の分子であることが知られており、この結果は免疫反応時に B細胞の細胞死が誘導され、免疫記憶が形成されないことを示している。
結果は以上で、残念ながら、生体内に移植したリンパ腫を阻害できるかどうかは示されていないが、胚中心阻害実験から、最初想定した機能を持つ化合物ができたことは間違いない。リンパ腫となると、CDK9 だけでなく、同じ機能を持つキナーゼも使われている可能性があるので、いくつかの化合物を合わせて使う必要があるかもしれない。いずれにせよ、BCL6結合部位特異的に転写誘導を起こすことから、CDK9阻害剤だけと比べると、副作用は少ない。また、胚中心阻害活性は、自己免疫病の阻害剤としても使える。
いずれにせよ、阻害剤を活性化剤として使うという面白い発想の研究だ。
2024年10月6日
ようやく秋の空気を感じる昨日今日だが、今年のような暑さを異常気温などと片付けられなくなってきた。実際、２４年の大気中の炭酸ガス濃度は昨年より０.７%も上昇しているようだ。これに対し、様々な二酸化炭素削減のための技術が進められているが、削減自体にエネルギーが必要で、決め手にはなっていない。
今日紹介する米国メリーランド大学からの論文は、地中から掘り出された分解されることなく３７７５年間地中で保存されていた杉の木を分析して、空気から遮断した状態で木材を地中に埋めることで地球の炭酸ガスを理論上２７％削減可能であることを示した面白い研究で、９月２７日 Science に掲載された。タイトルは「3775-year-old wood burial supports “wood vaulting” as a durable carbon removal method（３７７５年間地中に埋葬されていた木材は“木材地下金庫”が持続可能な炭素除去方法を指示する）」だ。
現在年間の化石燃料からの CO2 排出量は３７ギガトンらしいが、地球上の植物が吸収する炭酸ガスは２２０ギガトンに達する。もしこれらの植物が分解せずにそのまま保存できれば、その分 CO2 は減り続けることになるが、ほとんどは人間も含む生物により分解されもとの CO2 に戻る。それでも、間伐材など使わない木材を分解できないようにして地中に埋めて CO2 を削減する可能性は追求されていたようだ。
この研究は、地中に木材を封じ込める実験のための工事中に、カナダモントリオールの地下２ｍからほとんど分解されずに埋まっていた杉が発掘されたが、年代測定の結果なんと３７７５年前の杉であることがわかり、この研究が始まった。すなわち、もし４０００年近く分解されずに残っていたら、そのまま炭酸ガスを４０００年埋蔵していたことになり、木材封じ込め方法の有効性を強く示すことになる。
そこで、埋まっていた木材を洗浄して、炭素の保存状況を克明に調べるとともに、木が保存されていた状況について詳しく調べている。
まず木材だが、セルロースやリグニンなど、木材としての基本成分は完全に保存されており、炭酸ガスが炭素として保持されたことを示している。計算上だが、この間の炭素現象は５％以下に抑えられていると計算している。
次に、これほどの保存条件が実現したメカニズムを地層から探ると、水分が多い上に、上部を空気が通りにくい粘土層によりカバーされており、好気性の微生物を遮断し、木材の分解を遅くしたと考えられる。もちろん嫌気性バクテリアは存在しうるが、基本的にはリグニンは分解できずにセルロースが残ったと考えられる。
以上の結果から、森の維持に必要な間伐材など、現在焼却されたり放置されたりする木材を地中に埋めて、空気を遮断する土壌をかぶせることで、木材の封じ込めが可能になるのではと結論している。
その上でもしこれが可能なら、世界中で１０ギガトンの炭酸ガス排出を封じ込めることができ、これは現在化石燃料から排出される量の２７％になると結論している。
我々都会に生きていると、本当に大量の木材を地中に封じ込めることが現実的かどうか理解しづらいが、使用済み核燃料保存より遙かに安上がりな方法で、もちろんその上に通常の土壌をかぶせれば利用可能と思えるので、世界中で可能性を追求する価値は十分ある。ともかく、あらゆる可能性を試す以外、現状は変わらない。
2024年10月5日
TET2 はメチル化されたシトシンを酸化することで、最終的にメチル基を外す機能を持つ分子で、欠損すると造血幹細胞のクローン増殖を誘導し、白血病の引き金になることが知られている重要な分子だ。このブログでも TET2 を扱った論文については何度も紹介してきた。しかし、紹介するとき私の頭にあったメカニズムは、TET2 によりメチル化された DNA のメチル基が外れ、その結果様々な遺伝子の過剰発現が起こって増殖が高まるというものだった。特に DNA メチル化でトランスポゾンや内因性レトロウイルスなどが抑制されており、それが細胞内で活性化され増殖を高めていると考えてきた。
今日紹介するシカゴ大学からの論文は、私のこれまでの理解を完全にひっくり返し、造血細胞のクローン増殖に関わる TET2 の機能はメチル化された染色体構造変化に関わる RNA を標的にしていること、そしてこれにより内因性レトロトランスポゾンが活性化することが増殖に関わることを明らかにし、TET2 機能を考える上で重要な研究で、１０月２日 Nature にオンライン掲載された。タイトルは「RNA m5 C oxidation by TET2 regulates chromatin state and leukaemogenesis（RNA のメチル化シトシンを TET2 が酸化することがクロマチン構造を変化させ白血病化を誘導する）」だ。
TET2 をノックアウトすると ES 細胞のクロマチンはオープンになり転写が上昇する。TET2 は DNA と反応する時は特定の Zincfinger 分子が必要だが、RNA のメチル基と反応する時は PSPC1（RNA 結合分子）を必要とする。そこで TET2 ノックアウトの効果をメチル化 DNA とメチル化 RNA に分けて調べるために PSPC ノックアウト ES 細胞を調べると、染色体と結合するメチル化 RNA の濃度が高まり、この RNA が結合する領域のクロマチン構造がオープンになることがわかった。すなわち、TET2 はクロマチン構造の開閉を決めている RNA を脱メチル化することで、クロマチン構造を閉じる役割があり、これが欠損するとこの領域がオープンになる。
面白いことに、DNA メチル化によりクロマチン構造が調節されている領域はエンハンサーやプロモーター部位が多く、一方染色体に結合する RNA が調節している部位は、トランスポゾンや内因性のレトロウイルスの繰り返し配列が標的になっている。そして、TET2 や PSPC ノックアウトでは、このようなトランスポゾンのクロマチン構造がオープンになり、転写されていることを明らかにする。そして、この領域のクロマチン構造を決めているのが遺伝子発現を抑制する K119 部位がユビキチン化された H2A ヒストンで、TET2 ノックアウトでは、H2AK119ub が脱ユビキチン化が進んでクロマチンが開くことを明らかにしている。
最後に、H2AK119ub を除去する際のメカニズムを調べ、TET2 がノックアウトされるとクロマチン結合型メチル化 RNA が上昇し、これに MBD6（メチル結合分子）が結合すると、脱ユビキチン化酵素が H2AK119ub 結合部位にリクルートされ、ヒストンの脱ユビキチン化が進み、特定のクロマチンをオープンにすることを明らかにしている。言い換えると、TET2 はメチル化 RNA を脱メチル化することで、MBD6 とメチル化 RNA の結合を阻害し、H2AK119ub の脱ユビキチン化を抑えて、閉じたクロマチンを維持することがわかった。
ここまでの研究は全て ES 細胞で行われているが、最後に TET2 と MBD6 の役割を造血幹細胞で調べ、同じように TET2 がノックアウトされるとレトロトランスポゾンの発現が高まることが造血幹細胞の増殖を誘導すること、また MBD6 をノックアウトすることでメチル化 RNA の H2AK119ub の脱ユビキチン化阻害活性を抑えて、閉じたクロマチンを回復させ、幹細胞の異常増殖や、白血病かを抑えられることを示している。
結果は以上で、少しわかりにくかったかもしれないが、これまでの通説を覆す（少なくとも私の頭の中の）、優れた研究で、勉強した気分になる。
2024年10月4日
神経細胞にも幹細胞が存在し、様々な損傷によって活性化され、神経細胞を補えることが知られているが、この能力は老化とともに低下する。これまで、長く生存してきて疲弊するのは当然だと考えてしまっていたが、老化の研究が進むと、細胞全体が疲弊するのではなく、キーとなる過程が存在し、そこに介入することで、再活性できることもわかってきた。
今日紹介するスタンフォード大学からの論文は、CRISPR/Cas を使った遺伝子スクリーニングを行い、老化を促進する鍵となる経路を探索、老化神経幹細胞の再活性化を妨げる因子を特定したという研究で、１０月２日 Nature にオンライン掲載された。タイトルは「 CRISPR–Cas9 screens reveal regulators of ageing in neural stem cells（ CRISPR-Cas9 スクリーニングにより神経幹細胞の老化調節機構が明らかになった）」だ。
方法は極めてストレートで、Cas9 を発現している老化神経幹細胞培養にレンチウイルスで遺伝子を切断するガイドを導入し、一定期間培養後、どのガイドが濃縮されるかを調べている。もし特定の遺伝子が幹細胞の再活性化を妨げていたら、それが除かれた細胞はより増殖するため、ガイドの頻度から増殖抑制に関わる分子を特定できる。
そして、老化幹細胞だけで抑制効果がある分子を３０１個も特定している。次に、この中から効果の高い１０種類の遺伝子を選んで、今度は老化した Cas9マウスの脳内にガイド RNA を注射して遺伝子ノックアウトを行い、試験管内の結果が、生体内でも確認できることを示している。正直、ちょっと無理があるのではと思うスクリーニング方法だが、個々の遺伝子について一つづつノックアウトして確認している。
こうして得られた老化とともに発現が上昇して幹細胞の再活性化を抑える遺伝子のトップ１０は、シリア形成、アルツハイマー病リスク遺伝子、そしてグルコーストランスポーターだった。
この研究では、おそらく研究のしやすいグルコーストランスポーター、GLUT4 に絞ってその後の解析を進めている。GLUT4 はインシュリン依存性のトランスポーターで、細胞のグルコース取り込に関わる。例えばグルコースが高いのに高インシュリンが続くインシュリン抵抗性では当然発現が上昇する。インシュリンと関係するかどうかはわからないが GLUT4 は老化とともに上昇する。そして、老化マウスでだけノックアウトすることで、幹細胞の再活性化能力を高めることができる。
さらに、グルコースを除去した培地で培養すると、老化細胞を活性化することができ、またグルコースの分解を阻害する 2DG を加えても、活性化能力が回復する。また、老化幹細胞では、グリコリシスが高まる一方、ミトコンドリアの活性が低下していることも確認している。
以上が結果で、最後は一般的に知られているように、老化には糖質制限が重要という結果に終わっているが、今後、他の遺伝子の機能を追求することで、老人の脳でも、損傷時の再生能力を高める可能性が生まれるかもしれない。
2024年10月3日
Acinetobacter baumannii (Abm) のような病院内で発生する多剤耐性菌は現代の医療に残された重要問題で、このブログでも紹介したように、耐性のでない新しい抗生物質の開発が続いている。一方で、抗生物質とは異なるメカニズムで細菌を殺す溶菌ファージを用いて耐性菌を制御するための研究も進んでおり、やはり何度も紹介してきた。
今日紹介するハンガリーの生物学研究センターからの論文は、治療の対象となる Abm のゲノムを世界中から集め、その系統進化と多様化を徹底的に調べ、最適なファージ治療の可能性を追求した研究で、９月２６日 Cell にオンライン掲載された。タイトルは「Genomic surveillance as a scalable framework for precision phage therapy against antibiotic-resistant pathogens（多剤耐性病原菌に対するプレシジョンファージ治療の大規模なフレームワークのためのゲノム探索）」だ。
ハンガリーからの論文を見ることはほとんどないが、ノーベル医学生理学賞で言えば、RNA ワクチンのカリコさんもハンガリー人だし、私たちの世代にとってはビタミンＣや筋肉研究で有名なセントジェルジが思い出される。
研究の着想は極めて論理的で、ファージ治療を成功させるために、まず Abm の多様性を徹底的に調べ、できるだけ多くをカバーできるファージ分離の原理を突き止めようとしている。まさに、Covid-19 の際全世界で進んだウイルスの進化地図作成と同じ方向性だ。
日本を含む Abm ゲノムデータベースから１５４１０のゲノムを取り出し、配列に基づく系統樹とともに、ファージ感染では最も重要になるカプセルの合成に関わるゲノム領域に焦点を当てた系統樹を作成している。
こうして浮き上がってきたのは、コロナウイルスと異なり、都市や地域に限定されて進化していく点で、病院を中心として感染が起こることを裏付けている。従って、地域が異なると多様性は大きくなるが、それでもほぼ全ては３１種類の頻度の高いタイプに分類することができる。
もう一つ重要なのは、各地域で見ると多様性の形成が遅く長期にわたって変化が少ないことで、コロナウイルスのように同じ地域で急速に多様化するようなことはない。すなわち、現存の Abm から有効なファージを分離できる可能性が高い。
そこで、ハンガリーやルーマニアから実際の Abm 株を分離、そこから最も頻度が高い１１タイプの Abm に反応できる、１５種類のファージを分離することに成功している。
このファージを実際の Abm に感染させ、ファージに対する耐性の出方を調べた結果、それぞれのファージに対して異なる遺伝子の変化が起こることが明らかになり、いくつかのファージを組み合わせることで、ほぼ耐性の出現を抑えられることを示している。その上で、マウス腹腔に Abm を注射し、そこにファージを感染させる実験で、一週目での生存を調べると、ファージなしでは１日で全部が死亡するが、ファージにより７日目の生存率が80−100％になることを示している。
さらに、ファージ感染で発生した耐性菌は、驚くことにそれまで耐性を持っていた抗生物質に対する感受性が戻ることも明らかにし、抗生剤との新しい協調を誘導できる可能性を示している。
以上が結果で、よく読んでみると、論理立てに読者の頭を導くような仕掛けで、本当は世界中の Abm を調べなくても、ファージ治療を開発できるのではと思うが、査読者も含めてうまく読者を誘導することも重要な技術だと思う。おそらく限られた予算の中で、できることをうまくストーリーに仕上げた点で、勉強になる論文だと思う。
2024年10月2日
このブログでも何度も取り上げたが、細胞内の標的分子にタンパク質分解システムをリクルートして抑制する方法が、創薬の一つの方法として利用されるようになっている。そのほとんどは標的タンパク質にユビキチンリガーゼをリクルートする方法なので、細胞内のタンパク質に限られる。
これまで細胞表面に存在するタンパク質については、細胞膜からリソゾームへとリクルートし分解する方法が試みられている。ただ、表面タンパク質が細胞内小胞へ取り込まれてからの輸送経路が複雑で、完全に分解する経路へ導くことは簡単ではなかった。
今日紹介するハーバード大学からの論文は、細胞表面から常に細胞内小胞へインターナライズされ、その後また細胞表面へリクルートされるトランスフェリン受容体を用いて、細胞表面分子をリソゾームへとリクルート、分解する方法の開発研究で、９月２５日 Nature にオンライン掲載された。タイトルは「Transferrin receptor targeting chimeras for membrane protein degradation（膜タンパク質分解のためのトランスフェリン受容体へリクルートするキメラ分子）」だ。
トランスフェリン受容体に着目したのは、常にインターナライズされ膜と小胞を行き来しているという性質と、正常細胞と比べるとガン細胞で何十倍も発現が高いという性質だ。これにより、標的分子が正常細胞に発現していても、ガン細胞だけリサイクル経路で処理する可能性が出る。
そこでまず T細胞白血病細胞に発現させたキメラ抗原受容体 (CAR) をモデルとして、様々なタイプの CAR に結合するタンパク質とトランスフェリンに結合するタンパク質（抗体やリガンド）を結合させた分子を結合させ、CAR-T に加えると、細胞表面分子をトランスフェリン受容体へとリクルートし、細胞内小胞へインターナライズすることができるが、トランスフェリンと同じように一部がリサイクルされてしまって、分解されないことがわかった。
そこでトランスフェリンに結合するリガンドと、標的分子に結合する分子の間に、小胞体で働く酵素によって切断できるようにし、トランスフェリン受容体とは異なる、リソゾーム経路へ標的分子をリクルートする方法を開発し、最終的に８０％近くの標的分子を完全に分解できる方法に発展させている。
次に、CAR のような人工的標的ではなく、PD-L1、EGF 受容体、CD20 など、抗体治療の標的として使われている分子を標的に同じ方法が使えるか調べ、全ての分子をリソゾームへとリクルートし分解できることを示している。
最後に、EGF 受容体に依存性の非小細胞性肺ガンをモデルに、EGF 受容体を分解できるか検討している。非小細胞性肺ガンに対しては EGF 受容体を標的にする抗体治療が行われているが、様々な変異により抗体の効果が失われる。しかし、ともかく EGF 受容体が発現しておれば分解経路へとリクルートできるこの方法は、抗体治療の効果がなくなったガンに対しても効果がある。また、EGF 受容体を発現する正常線維芽細胞にはほとんど影響がない。
最後に、EGF 受容体に対する抗体治療が効かなくなった腫瘍を移植したマウスに、この方法を試すと、EGF 受容体を分解して、ガンの増殖を抑えることを示している。
結果は以上で、臨床応用までは時間がかかるとしても、細胞表面分子をリソゾームへと導く方法開発の意義を明確に示した研究だと思う。特に驚いたのは、EGF 受容体に対する抗体と、トランスフェリン受容体に対する抗体を結合させた、彼らが TAC と名付けたキメラ分子の血中の半減期が、抗体より長く１６日もあることで、治療する側から見ても使いやすい方法に成長するのではないだろうか。
2024年10月1日
これほどメタゲノミックスが進んだ現在でも、新しい細菌が発見され続けている。今日紹介する米国、クリーブランドクリニックからの論文は、マウス腸内細菌叢を IgA 分解活性を指標にスクリーニングし、Tomasiella immunophila と名付けた新しい細菌を発見した研究で、９月２７日 Science に掲載された。タイトルは「A host-adapted auxotrophic gut symbiont induces mucosal immunodeficiency（ホストに適応した栄養要求性腸内共生細菌は粘膜免疫不全を誘導する）」だ。
細菌は様々なタンパク質分解酵素を持つので、腸内免疫に働く IgA を分解する活性を持ってることは十分考えられる。そこで、腸内の IgA が高いマウスと、低いマウスの細菌叢を分離して、IgA に作用させると、低いマウスのみ IgA を分解することを発見する。
次に、細菌培養を繰り返して IgA 解能を持っている細菌を絞り込んでいくと、テトラサイクリン抵抗性の Muribaculaceae 科に属する新しい細菌が特定され Tomasiella immunophila と名付けている。
この細菌の培養には細胞壁成分で、通常のバクテリアは自分で産生するN-アセチルムラニル酸が必要で、これを回りの細菌から調達して生きていると考えられる。さらに、無菌マウスに移植しても腸内で増殖できず、他の細菌叢との協力の下初めて腸内に居着くことができている。面白いことに、免疫不全マウスでは他の細菌叢が助けてくれても腸内での生存が低下していることから、IgA を何らかの形で細菌叢での生存に役立てている可能性がある。
この細菌、あるいは細菌由来の小胞に存在する酵素は、免疫グロブリンの κ鎖を分解し、こうしてH鎖とL鎖が分離すると、他の酵素がさらに働いて免疫グロブリン、腸内ではIgAが完全に分解される。
この活性はマウス腸間内でも発揮され、この細菌と IgA 分解能のない細菌叢を同時に加えたマウスの腸内では、IgA の量が低下する。そして、感染実験や、硫酸デキストランによる上皮障害実験を行うと、この細菌を加えたときだけ抵抗力が低下することを明らかにしている。
残念ながら、この細菌が持っている IgA 分解酵素の特定には至っておらず、またヒト IgA もこの細菌では分解できないこともわかった。
以上の結果から、Tomasiella immunophila はマウスとともに共進化してきたユニークな細菌で、示されてはいないが、おそらく IgA を一定程度分解することで、他の細菌との協力関係を築いて生存してきた様に思える。ただ、様々な病的状態では、この機能が逆にホストの抵抗力低下を促すことも示されていることから、共生菌としての生態についてはまだまだ研究が必要だと思う。また、同じような菌が人間にも存在するかの特定も残っている。このように、多くの問題が未解決のまま残されたフラストレーションを感じる論文だが、新しい不思議な細菌の発見という点では面白い。
