組織レベルで細胞ごとに多くの遺伝子の発現を調べる方法が急速に進んでおり、AASJでも新しい組織学としてYouTube配信を2年前に行った（https://www.youtube.com/watch?v=KtjY4JEEjaA）。これまで開発された方法は、バーコード配列を組織上で読み取って mRNAをsingle molecule レベルで特定する方法と、識別のための読み取り配列を持つプローブを標的にハイブリダイズさせたあと、読み取り配列を検出する蛍光ラベルしたプローブを組織上で何度も繰り返す方法に分かれる。特に後者の方は必要なリエージェントやRNAの数を細胞ごとにカウントするソフトも提供され、また外注でサービスを受けることもできることから、普及が進んできた。

とは言え、MERFISHは一つの遺伝子に何個ものプローブが必要で、コストも含めて気軽に使えるというレベルにはなっていない。今日紹介するイェール大学からの論文は、MERFISHを利用するが、新しく開発したRNAを組織内で増幅する方法を組み合わせることで、MERFISHを一つのプローブだけでできるようにし、感度を上げた上にコストを下げることに成功した方法開発研究で10月1日 Cell にオンライン掲載された。タイトルは「Sequencing-free whole-genome spatial transcriptomics at single-molecule resolution（配列決定が必要でない単一分子解像度での全ゲノム空間トランスクリプトミックス）」だ。

これまでも組織上でRNAを増幅することは行われていたが、この研究では標的のRNAに接して結合する2種類のプローブに、片方には増幅のためのプライマー、もう片方には増幅される配列を結合させて、ハイブリダイゼーションしたRNA上でプライマーから標的配列まで何度も増幅できるようにしている。トリックとして、増幅される共通配列には最初切断を入れておいて、増幅が標的配列まで進まないようにしておく。まずこれを連結させる操作を行ったあと、プライマーから増幅させると、今度は標的のRNAも配列まで到達して増幅させることができる。この増幅したDNA配列を標的にMERFISHを行うと、一つのプローブで十分検出が可能になる。

この増幅セットを転写される全ての遺伝子に対して用意しておいて、増幅後にMERFISHで増幅された遺伝子を検出すると、一つのRNAは一個の明確なドットとして検出できる。人間で転写される16501個のコーディングRNAと、6811個のノンコーディングRNA全ての発現解析を肺ガン細胞株で行うと、一個の細胞あたり平均3749個のRNA を検出できる。

これまでin situ hybridizationというと、見たい遺伝子を決めて調べる方法だったが、一つの組織で全遺伝子について発現を調べられるということは、細胞が発現している遺伝子について予断を完全に排して解析ができることを意味する。即ち現在定番になった single cell RNA sequencing と同じレベルの解析に、組織上の局在まで加えて解析が可能になった。

このパワーを示すためいくつかの例を選んで解析を行っている。まず培養細胞を用いて全ゲノムレベルの発現解析を行うと、多くの遺伝子発現を見事に細胞周期ごとに振り分けることができる。中でもこれまで解析が進んでいないノンコーディングRNAのうち99種類は明確に細胞周期に割り当てられることを示している。

次に構築と全ゲノム発現解析を合体させるパワーを示すため、肝臓組織について同じように全ゲノムレベルの発現解析を行い、single cell RNA seq 以上の解像度で細胞を分類できること、さらにそれぞれの細胞が組織のどこに存在するのかについて明らかにすることに成功している。このおかげで、それぞれのゾーンに分布する細胞間の相互作用についても発現遺伝子から推定することができる。

他にも胎児の胎盤、あるいは免疫反応が起こっているリンパ節についても解析を行い、例えば胎盤では血管内皮、赤芽球、栄養膜細胞、マクロファージなどの局所での相互作用の様態を示したり、リンパ節では様々なゾーニングとともに胚中心がはっきりと他のゾーンから区別できることも美しい写真で示している。

他にもクリスパーノックアウトとの組み合わせられることなどを示しているが割愛する。結局論文を読んで貰わないと、どれだけパワフルな方法かを文章だけで伝えることはむずかしい。要するに、組織上で全ゲノムレベルの遺伝子発現を解析できる、これまでより高い信頼性を持った方法が開発されたことがこの研究の全てだ。あとは個々の生物学的問題をこの方法で解析していくことで評価が定まると思う。

この研究では、全ゲノム分のプローブを作る（あるいは買う）と、あとは増幅していくらでも新しい実験に使えることから、コストもMERFISHより遙かに安上がりだとしている。組織上での増幅に必要な全プローブのコストは、5100ドルで、2000回の実験が可能でとしているので、本当なら是非試してみる価値はある。ひょっとしたら、組織全ゲノム解析の定番になるかもしれない。